谷氨酰胺聯(lián)合維生素C對(duì)熱應(yīng)激致大鼠腸源性內(nèi)毒素血癥的預(yù)防作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　 中暑(heat illness)是指在高溫環(huán)境和熱輻射的長(zhǎng)時(shí)間作用下發(fā)生的一組急性疾病，由于不同個(gè)體對(duì)高溫耐受的差異，出現(xiàn)體溫調(diào)節(jié)功能障礙，水、電解質(zhì)代謝紊亂，引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)及循環(huán)系統(tǒng)障礙產(chǎn)生各種臨床癥狀的總稱。因溫室效應(yīng)導(dǎo)致全球氣候變暖，中暑逐漸成為夏季的一種常見(jiàn)病和多發(fā)病，在高溫環(huán)境下進(jìn)行野外日常軍事訓(xùn)練的官兵，從事高強(qiáng)度的體力作業(yè)，其發(fā)病率及死亡率均逐年上升，故近年來(lái)軍隊(duì)已將防中暑寫(xiě)入新版的共同條

2、令。相關(guān)研究提示，當(dāng)機(jī)體體溫升高致腸粘膜上皮細(xì)胞的阻力下降，引起細(xì)胞旁路開(kāi)放增加，導(dǎo)致腸道內(nèi)毒素(endotoxin，ET)及其所介導(dǎo)的炎性介質(zhì)大量進(jìn)入機(jī)體的血液循環(huán)，形成腸源性內(nèi)毒素血癥(intestinal endotoxemia)；而腸源性內(nèi)毒素血癥在中暑過(guò)程中的作用及預(yù)后影響也逐漸引起醫(yī)學(xué)界的高度重視。目前相關(guān)研究認(rèn)為氧化應(yīng)激反應(yīng)及腸源性內(nèi)毒素血癥是中暑和其并發(fā)癥發(fā)生的重要病理生理學(xué)基礎(chǔ)。腸粘膜屏障功能作為機(jī)體免疫防御系統(tǒng)的重要

3、組成部分之一，在整個(gè)中暑的應(yīng)激過(guò)程中可能發(fā)揮著十分重要的作用。
　　 中暑的病因十分復(fù)雜，決定了其預(yù)防及治療方法應(yīng)針對(duì)不同的發(fā)病機(jī)制，單一用藥往往難以取得較好的效果，聯(lián)合用藥、多環(huán)用藥療效確切。谷氨酰胺是一種高效抗氧化劑，它可直接作用于腸粘膜上皮細(xì)胞，并對(duì)腸粘膜上皮細(xì)胞的分化、增值、修復(fù)和再生有很強(qiáng)的促進(jìn)作用，可有效減少腸道內(nèi)毒素及其炎性介質(zhì)入血，對(duì)腸粘膜結(jié)構(gòu)和屏障功能起到積極的保護(hù)作用。維生素C亦是一種高效抗氧化劑，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生

4、的氧自由基有很強(qiáng)的清除作用，它可以降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，有效減輕組織損傷并促進(jìn)組織修復(fù)，提高腸粘膜屏障防御功能，降低腸源性感染發(fā)生幾率，從而對(duì)熱應(yīng)激致中暑產(chǎn)生有效的保護(hù)作用。Toll受體在中暑所致的全身性內(nèi)毒素血癥的發(fā)病機(jī)制方面起著引導(dǎo)作用，TLR2受體作為T(mén)oll家族的重要組成之一，在連接細(xì)胞間相互作用及主導(dǎo)信號(hào)傳輸方面起著重要作用，并與機(jī)體產(chǎn)生的特定基因表達(dá)及細(xì)胞外信號(hào)傳導(dǎo)中起著橋梁作用，被公認(rèn)為是機(jī)體炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)閘門(mén)之一，已經(jīng)成為醫(yī)

5、學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。HSF1作為一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可以通過(guò)調(diào)控其下述的信號(hào)傳遞通路發(fā)揮其在熱應(yīng)激反應(yīng)中的功能，正確闡述HSF1分子的作用機(jī)制也逐漸成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域一個(gè)非常重要的研究方向。為研究藥物對(duì)熱應(yīng)激致大鼠腸源性內(nèi)毒素血癥的預(yù)防作用，我們應(yīng)用臨床常用的谷氨酰胺聯(lián)合維生素C來(lái)進(jìn)行中暑的預(yù)防用藥，在延續(xù)前期人體實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)從機(jī)制方面進(jìn)一步研究。通過(guò)熱應(yīng)激耐力實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SD大鼠小腸組織的超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)

6、、血清內(nèi)毒素含量的變化及TLR2mRNA的表達(dá)；通過(guò)高溫致死實(shí)驗(yàn)觀察各組受試大鼠的存活時(shí)間，檢測(cè)熱休克轉(zhuǎn)錄因子1(HSF1)的表達(dá)變化及小腸組織超微結(jié)構(gòu)的改變，來(lái)進(jìn)一步探討谷氨酰胺聯(lián)合維生素C對(duì)熱應(yīng)激致腸源性內(nèi)毒素血癥的發(fā)生機(jī)制及對(duì)中暑的預(yù)防效果，為臨床藥物預(yù)防中暑提供理論依據(jù)。
　　 研究方法：
　　 1、SD大鼠熱應(yīng)激耐力實(shí)驗(yàn)：將160只Sprague-Dwley(SD)健康雄性大鼠，12-14周齡，體質(zhì)量(205±

7、25)g，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為5組：谷氨酰胺聯(lián)合維生素C組、谷氨酰胺組、維生素C組、高溫應(yīng)激組、正常對(duì)照組。將前四組同時(shí)放入人工氣候箱中，模擬高溫中暑環(huán)境模型，每天應(yīng)激2小時(shí)后取出；正常對(duì)照組放置于室溫。人工氣候箱內(nèi)模擬溫度為：(38±1)℃、相對(duì)濕度為：(65±10)%。谷氨酰胺腸溶膠囊灌胃劑量為216 mg/(kg·d)，維生素C片灌胃劑量為135mg/(kg·d)，均1次/天。同批次應(yīng)激各組均于每天實(shí)驗(yàn)前60min給藥，用生理鹽水

8、5ml溶解稀釋后行大鼠灌胃。單一用藥組分別給予單一灌胃，聯(lián)合用藥組給于兩種藥物聯(lián)合灌胃，高溫應(yīng)激組用生理鹽水5ml灌胃。實(shí)驗(yàn)前各組均可自由進(jìn)食進(jìn)水，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中禁食禁水，實(shí)驗(yàn)后可繼續(xù)自由進(jìn)食進(jìn)水。分別于應(yīng)激后第1、3、7、15d用4mg/Kg的2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉取清潔小腸組織放置于液氮罐中，并立即心臟采血2-3ml注入專用的無(wú)熱源試管內(nèi)，以4000r/min離心10min，取上層血清樣本存放于-20℃冰箱，統(tǒng)一進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。取標(biāo)本

9、前24h禁食，4h禁水。運(yùn)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)小腸組織Toll樣受體2(TLR2)mRNA的表達(dá)，從機(jī)制上探索腸粘膜屏障功能在熱應(yīng)激致腸源性內(nèi)毒素血癥中的變化。
　　 2、SD大鼠高溫致死實(shí)驗(yàn)：將40只Sprague-Dwley(SD)健康雄性大鼠，11-13周齡，體質(zhì)量(200±15)g，清潔級(jí)，隨機(jī)分為谷氨酰胺聯(lián)合維生素C組、谷氨酰胺組、維生素C組、高溫應(yīng)激組、正常對(duì)照組，每組8只。將前四組同時(shí)放入人工氣候箱中持續(xù)行高溫應(yīng)

10、激，人工氣候箱內(nèi)溫度為：(41±0.5)℃、相對(duì)濕度為：(65±20)%；正常對(duì)照組放置于室溫。待高溫致死后立即取小腸組織，隨機(jī)分為三份，一份存放于液氮罐中進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)；一份用10%多聚甲醛固定分別行HE染色實(shí)驗(yàn)觀察小腸組織結(jié)構(gòu)及免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HS目的表達(dá)；另一份用2.5%戊二醛固定行透射電鏡實(shí)驗(yàn)觀察小腸粘膜上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1、SD大鼠熱應(yīng)激耐力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：(1)與正常對(duì)照組相比

11、，在同時(shí)間段高溫應(yīng)激各組SOD含量明顯降低，而MDA、血清內(nèi)毒素、TLR2mRNA表達(dá)量均明顯升高(p<0.05)，三個(gè)藥物干預(yù)組SOD、MDA含量同比無(wú)明顯差異(p>0.05)，單用谷氨酰胺組、維生素C組血清內(nèi)毒素含量及TLR2mRNA表達(dá)量均明顯升高(p<0.05)，谷氨酰胺組聯(lián)合維生素C組血清內(nèi)毒素含量及TLR2mRNA表達(dá)量無(wú)明顯差異(p>0.05)。(2)與高溫應(yīng)激組比較，在同時(shí)間段三個(gè)藥物干預(yù)組SOD含量均顯著升高(除第7天

12、谷氨酰胺組、維生素C組外)；而MDA、內(nèi)毒素含量及TLR2mRNA表達(dá)量均明顯降低(除第3天、第15天的維生素C組TLR2 mRNA表達(dá)量外)(p<0.05)。(3)與谷氨酰胺組、維生素C組比較，同時(shí)間段谷氨酰胺聯(lián)合維生素C組SOD含量較相近，但MDA和血清內(nèi)毒素含量及TLR2mRNA表達(dá)量均明顯降低(p<0.05)。
　　 2、SD大鼠高溫致死實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：(1)與同時(shí)間段高溫應(yīng)激組比較，三種藥物干預(yù)組大鼠的存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)(

13、p<0.05)；同時(shí)間段谷氨酰胺聯(lián)合維生素C組大鼠的存活時(shí)間明顯長(zhǎng)于單用谷氨酰胺組、維生素C組(p<0.05)。(2)同時(shí)間段谷氨酰胺聯(lián)合維生素C組HS目的光密度均值明顯高于正常對(duì)照組及高溫應(yīng)激組(p<0.05)，單用谷氨酰胺組及維生素C組HS目的光密度均值與正常對(duì)照組及高溫應(yīng)激組相比無(wú)明顯差異(p>0.05)；同時(shí)間段聯(lián)合用藥組與單一用藥組相比，HS目的光密度均值無(wú)明顯差異(p>0.05)。(3)透射電鏡觀察谷氨酰胺聯(lián)合維生素C組小腸

14、粘膜微絨毛、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)基本正常，受損較輕；單用谷氨酰胺組細(xì)胞核可見(jiàn)均勻化改變，單用維生素C組可見(jiàn)細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)水腫、電子密度降低等改變；而高溫應(yīng)激組的小腸粘膜細(xì)胞受損較重，微絨毛紊亂，胞漿、胞核溶解，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體均明顯腫脹。同批次實(shí)驗(yàn)中，藥物干預(yù)組的SD大鼠的存活及對(duì)熱應(yīng)激的耐受時(shí)間較高溫對(duì)照組延長(zhǎng)，以聯(lián)合用藥組最為明顯。
　　 結(jié)論：
　　 本課題研究結(jié)果表明：
　　 一、作為小腸組織粘膜營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)

15、能量來(lái)源及抗氧化應(yīng)激制劑，谷氨酰胺聯(lián)合維生素C可有效減少高熱應(yīng)激對(duì)小腸組織黏膜屏障的損傷，同時(shí)可以促進(jìn)小腸組織粘膜的修復(fù)，保護(hù)小腸黏膜屏障功能，有效的降低腸源性內(nèi)毒素血癥的發(fā)生，可用于熱應(yīng)激致腸源性內(nèi)毒素血癥及高溫中暑的預(yù)防。
　　 二、谷氨酰胺聯(lián)合維生素C預(yù)防腸源性內(nèi)毒素血癥及高熱中暑的機(jī)制可能為：
　　 1.升高熱應(yīng)激后小腸組織SOD含量，降低MDA、TLR2mRNA的含量，可有效抑制氧自由基，降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，可抑