TLR2、4在內(nèi)毒素血癥幼鼠腸損傷的作用機(jī)制和谷氨酰胺與腸三葉因子保護(hù)機(jī)制的研究.pdf

1、腸粘膜屏障包括機(jī)械屏障、生物屏障和免疫屏障，三者共同構(gòu)成一道嚴(yán)密的保護(hù)層，在阻止腸腔內(nèi)細(xì)菌、毒素進(jìn)入機(jī)體并維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定上起重要作用。因此，目前認(rèn)為腸道功能障礙是導(dǎo)致多器官衰竭的重要因素之一。 感染、敗血癥是兒科常見(jiàn)病之一，其危重癥常伴發(fā)胃腸功能障礙，出現(xiàn)腹脹、腸鳴音減弱或消失等癥狀體征。此時(shí)，常提示病情加重和預(yù)后不良，晚期病死率極高。腸粘膜受損致屏障功能障礙是腸功能衰竭發(fā)生的病理機(jī)制之一。因此，對(duì)其機(jī)制研究并探討有效的保護(hù)

2、措施成為研究的重點(diǎn)。 內(nèi)毒素血癥可通過(guò)缺氧、炎癥介質(zhì)釋放、自由基增多使腸粘膜屏障受損，致使大量細(xì)菌易位，引起遠(yuǎn)隔器官感染，最終造成多器官功能衰竭，甚至死亡。TLR能夠識(shí)別外源性微生物，在病原體入侵機(jī)體時(shí)啟動(dòng)先天性免疫反應(yīng)，清除侵入的病原微生物。TLR胞內(nèi)區(qū)結(jié)構(gòu)與白介素-1受體(Interleukin-1 Receptor，IL-1R)高度同源，稱為TIL區(qū)(TLR/IL-IR homologous region)。LRR是蛋白質(zhì)

3、和蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)構(gòu)基序，可以直接識(shí)別和結(jié)合病原體或其產(chǎn)物，激發(fā)機(jī)體的非特異性免疫反應(yīng)。與IL-IR同源的胞內(nèi)區(qū)與核轉(zhuǎn)錄因子-kB(NF-KB)的激活有關(guān)。 谷氨酰胺(Glutamine，Gln)是機(jī)體含量最豐富的條件氨基酸，是許多快速分裂細(xì)胞，如腸上皮細(xì)胞，淋巴細(xì)胞等的能源物質(zhì)，也是合成核苷酸的前質(zhì)，可促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成和抑制蛋白質(zhì)的降解，因此，Gln是維持腸道粘膜代謝、結(jié)構(gòu)和功能的必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)維護(hù)腸粘膜的細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和

4、增殖以及維持腸道粘膜上皮的完整性具有重要意義。但以往對(duì)Gln在腸粘膜功能上的作用，主要集中在營(yíng)養(yǎng)方面，而對(duì)Gln減少炎癥介質(zhì)釋放的作用機(jī)制并未闡明。 腸三葉因子(Intestinal trefoil factor，ITF)是三葉肽家族成員之一，廣泛存在于胃腸道，具有特征性的三葉結(jié)構(gòu)。為此，本研究以LPS誘導(dǎo)內(nèi)毒素血癥，致幼鼠腸損傷為對(duì)象，探討TLR在腸損傷的作用機(jī)制及谷氨酰胺和腸三葉因子在腸損傷的保護(hù)機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)材料與方

5、法: 一、動(dòng)物模型及分組 Wistar健康10同齡幼鼠，雌雄不限，體重15-25g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬二院醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。以LPS 5mg/kg腹腔注射的方法制備Wistar幼鼠內(nèi)毒素血癥的模型。72只幼鼠以腹腔注射藥物的不同，分為NS組、LPS組、Gln組和ITF組。 二、標(biāo)本采集和處理 NS組、Gln組、ITF組均于腹腔注射后3h，LPS組分別于腹腔注射后3、6、12、24、48、72h給予10

6、％水合氯醛腹腔注射麻醉，處死，并按要求處理和保存。 三、實(shí)驗(yàn)方法: 1、動(dòng)態(tài)觀察幼鼠的一般狀態(tài)和死亡情況。 2、病理形態(tài)學(xué)研究。 四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均以均值士標(biāo)準(zhǔn)差(-x±S)表示，差異比較用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟包進(jìn)行方差分析，組間比較用LSD法檢驗(yàn)及制作統(tǒng)計(jì)圖。 結(jié)果: 一、幼鼠的一般狀況對(duì)照組 動(dòng)物腹腔注射NS后進(jìn)食、活動(dòng)正常。LPS組動(dòng)物在腹腔注射LPS后出現(xiàn)腹瀉、腹脹

7、明顯等胃腸功能障礙癥狀，死亡率約8.3％。而Gln組和ITF組上述臨床癥狀較內(nèi)毒素組輕，無(wú)死亡。 二、幼鼠腸組織病理學(xué)變化: 1、大體觀察：LPS組動(dòng)物在腹腔注射LPS后3h可見(jiàn)腸管、腸系膜輕度充血腫脹，6h時(shí)可見(jiàn)充血腫脹明顯，有胃潴留，部分腸管擴(kuò)張，腸腔內(nèi)有出血；12h上述癥狀明顯，24h仍有胃潴留及腸管充血，72h上述癥狀有好轉(zhuǎn)。Gln組和ITF組以上癥狀較內(nèi)毒素組輕，NS組無(wú)明顯變化。 2、光鏡變化：NS組

8、腸絨毛完整，無(wú)明顯異常改變。LPS組給予LPS后3h腸組織可見(jiàn)明顯異常；6h見(jiàn)間質(zhì)水腫吸收，充血不明顯，杯狀細(xì)胞增加，上皮細(xì)胞仍水腫，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)玻璃樣物質(zhì)，呈透明樣變；12h上述變化更加明顯；24h可見(jiàn)絨毛間質(zhì)、上皮細(xì)胞水腫明顯減輕，杯狀細(xì)胞仍較多：48h上述改變明顯恢復(fù)；72h恢復(fù)明顯。Gln組和ITF組有絨毛間質(zhì)輕度充血，無(wú)明顯水腫，細(xì)胞輕度水腫，較LPS組明顯減輕，杯狀細(xì)胞明顯增加。 3、電鏡變化：NS組上皮細(xì)胞柱狀，核呈

9、卵圓形，頂部微絨毛排列整齊，細(xì)胞間緊密連接完整，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體清晰；內(nèi)毒素作用下頂部微絨毛疏松，輕度水腫，微絨毛排列不整、部分?jǐn)嗔?、缺失，部分緊密連接增寬或斷裂，細(xì)胞核固縮，形成凋亡小體，染色質(zhì)邊聚。LPS作用后3h既有改變，至24h細(xì)胞損傷達(dá)到高峰，72h有所恢復(fù)。 三、幼鼠腸組織TNF-α、IL-4、IL-10的變化腹腔注射LPS后3h腸組織TNF-a、IL-4、IL-10分泌明顯增加，較NS組有顯著差異(P<0.05)，T

10、NF-α增加更為明顯；TNF-α、IL-4、IL-10分泌均于6h達(dá)到高峰，于12h有所下降，24h腸組織TNF-α稍高于NS組(P>0.05)，IL-4、IL-10又明顯增加(P<0.01)，至72h下降；Gln組和ITF組腸組織TNF-α、IL-4、IL-10明顯低于LPS組，差異非常顯著(P<0.01)。 四、幼鼠腸組織TLR2、4和NF-kBmRNA表達(dá)的變化在NS組TLR2 mRNA表達(dá)較弱，TLR4 mRNA表達(dá)較明

11、顯，NF-kB mRNA稍有表達(dá)。TLR2 mRNA在LPS組各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)明顯高于NS組，且差異非常顯著(P<0.01)；TLR2 mRNA表達(dá)逐漸增高，于72h達(dá)高峰。TLR4 mRNA表達(dá)在LPS腹腔注射3h即達(dá)到高峰，顯著高于NS組(P<0.01)，然后下降；于24h、48h又復(fù)增高；于72h明顯下降，且低于NS組，差異顯著(P<0.01)。NF-kB mRNA表達(dá)在LPS腹腔注射3h即達(dá)到高峰，顯著高于NS組(P<0.01)，然

12、后下降，明顯低于NS組，差異顯著(P<0.05)；于24h、48h又復(fù)增高，明顯高于NS組，差異非常顯著(P<0.01)；于72h明顯下降，且低于NS組，但無(wú)明顯差異(P>0.05)。 五、Gln對(duì)幼鼠腸組織TLR2、4和NF-kB mRNA及蛋白表達(dá)的影響1、NS組TLR2表達(dá)較弱，LPS組TLR2表達(dá)明顯增強(qiáng)，谷氨酰胺組TLR2表達(dá)明顯弱于LPS組，差異顯著(P<0.05)。TLR4在NS組有一定的表達(dá)，LPS組表達(dá)顯著上調(diào)

13、，差異非常顯著(P<0.01)，谷氨酰胺組表達(dá)明顯下調(diào)，差異非常顯著(P<0.01)。NF-kB在NS組表達(dá)非常弱，LPS組表達(dá)明顯增高，差異顯著(P<0.05)，谷氨酰胺組明顯下調(diào)，差異非常顯著(P<0.01)。 六、Gin對(duì)幼鼠腸組織TNF-α、IL-4、IL-10的影響LPS組TNF-α，IL-4，IL-10較NS組明顯增高，差異顯著(P<0.05或P<0.01)；Gln組TNF-α，IL-4，IL-10較LPS組明顯降低

14、，差異非常顯著(P<0.01)。Gln組IL-4，IL-10也明顯低于NS組，差異非常顯著(P<0.01)。 七、ITF對(duì)幼鼠腸組織TLR2、4和NF-kB mRNA及蛋白表達(dá)的影響1、TLR2 mRNA表達(dá)LPS組較NS組明顯增高，差異非常顯著(P<0.01)，ITF組較NS組、LPS組均明顯增高，且差異非常顯著(P<0.01)。腸組織TLR4、NF-kBmRNA表達(dá)在LPS組均也較NS組明顯增高，差異非常顯著(P<0.01)

15、，ITF組TLR4、NF-kB mRNA表達(dá)均較LPS組明顯降低，差異非常顯著(P<0.01)，且均低于NS組，TLR4降低更為明顯，差異顯著(P<0.01)。 八、ITF對(duì)幼鼠腸組織TNF-α，IL-4，IL-10的影響LPS組腸組織TNF-α較NS組明顯增高，差異非常顯著(P<0.01)，ITF組TNF-α較LPS組明顯降低，差異非常顯著(P<0.01)。腸組織IL-4，IL-10在LPS組較NS組顯著增高，差異非常顯著(P

16、<0.01)，ITF組IL-4，IL-10較LPS組、NS組均明顯降低，差異非常顯著(P<0.01)。 結(jié)論:1、LPS可引起幼鼠腸組織損傷，光鏡和電鏡均有不同程度的改變。Gln和rlTF可減輕病理變化，對(duì)腸組織損傷有保護(hù)作用。 2、在內(nèi)毒素血癥早期腸組織TNF-α，IL-4，IL-10均明顯增高。隨LPS作用的時(shí)間延長(zhǎng)，TNF-α下降，IL-4，IL-10再次增高，呈雙峰現(xiàn)象，這可能有利于抑制炎癥反應(yīng)，減輕炎癥介質(zhì)對(duì)

17、腸粘膜的損傷。 3、在正常腸組織中，TLR2與NF-kB mRNA和蛋白有較弱的表達(dá)，TLR4mRNA和蛋白有稍強(qiáng)的表達(dá)。LPS可使腸組織TLR2 mRNA和蛋白明顯上調(diào)，并隨著LPS作用時(shí)間的延長(zhǎng)，TLR2上調(diào)更加明顯。在LPS作用早期TLR4與NF-KBmRNA和蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，隨之下降，并隨LPS作用的時(shí)間延長(zhǎng)，再次增高，呈雙峰現(xiàn)象，同抑炎因子IL=4，IL-10的分泌吻合，TLR4可能有促進(jìn)IL-4，IL-10分泌的作