2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、背景: 腸三葉因子(intestinaltrefoilfactor,:ITF)是由腸道杯狀細胞特異分泌的具有特殊空間結構的小分子多肽[1],ITF不僅能促進細胞增殖和移行,還由于其空間結構中有和粘蛋白的寡聚糖或多糖側鏈結合的位點,使之形成穩(wěn)定的凝膠復合物,穩(wěn)定腸粘液層。此外,ITF具有蛋白酶水解抗性和酸堿穩(wěn)定性,可減輕多種致傷因子造成的消化道損害,這些特性決定了ITF在腸道的自我保護機制中占重要地位。目前對ITF的研究已很深入,

2、但有關ITF受體的研究相對滯后,ITF是否具有獨特的受體存在爭議,一些學者認為ITF沒有特異受體,它依賴表皮生長因子受體(EGFR)發(fā)揮生物學效應[2];另一些學者則持不同觀點,他們發(fā)現了一類能和ITF特異結合的蛋白,將其稱之為ITF結合蛋白,并對蛋白的基本特性進行了初步分析[3],但這些蛋白是否就是ITF受體還缺乏具有說服力的直接證據。 目的: 在成功獲取重組表達.ITF的基礎上,通過配體受體動力學研究和受體定位研究,

3、探索在腸上皮細胞上是否存在ITF特異受體,以及受體在細胞上的分布特點。 方法: 1.ITF在酵母中的表達和純化:將成功轉化的含ITF成熟肽序列的酵母X-33菌株進行Zeocin篩選,將陽性轉化子接種于YPD液體培養(yǎng)基中搖瓶表達,表達產物上清經硫酸銨分級沉淀、Ni-NTA親和層析、超濾離心三步純化以獲取重組表達的ITF。TricineSDS-PAGE及Westernbloting鑒定重組蛋白。 2.腸三葉因子受體放

4、射性配基結合實驗(Radioligandbindingassay,RLBA):摸索ITF受體放射性配基結合分析的最佳反應溫度、時間、細胞濃度和非標記ITF的濃度。在此條件下在IEC-6細胞上進行ITF受體放射性配基結合實驗,得到親和常數(KD)及最大結合容量(Bmax)。在相同的條件下對HT-29、5E6L、HaCat細胞上ITF受體進行分析,比較不同細胞上:ITF受體的差異。通過大量:EGF、ITF及EGFR阻斷肽對ITF受體和EGF

5、受體競爭抑制,證實ITF特異受體的存在。 3.腸三葉因子受體在腸上皮細胞上的定位:將傳代培養(yǎng)的IEC-6細胞用0.5%的胰酶消化后,細胞濃度調為約2.5×105個/ml,加入放有8×8mm蓋玻片的24孔板于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱孵育,待IEC-6腸上皮細胞貼壁,細胞爬片用PBS清洗3遍后與B-藻紅蛋白(B-PE)標記的ITF(BPE-ITF)在4℃下分別共同孵育0.5,1.0,2.0,4.0h,孵育結束后PBS清洗3遍×3mi

6、n,細胞片置于載玻片上并用90%緩沖甘油封片,激光共聚焦顯微鏡下觀察ITF受體在IEC-6細胞上的分布規(guī)律。并使用過量的EGF、ITF和EGFR阻斷肽進行競爭抑制實驗,觀察熒光的變化情況。 結果: 1.酵母表達獲得ITF,產物經TricineSDS-PAGE、Westernblot鑒定具有良好的抗原性和特異性,三步純化后重組蛋白的純度超過95%,表達量達到約50mg/L。 2.放射性配基結合實驗最佳反應條件為4℃

7、,孵育30min,細胞濃度為5.0×105個/ml,非特異結合配基濃度為標記配基的10000倍。在此條件下,對:IEC-6、HT-29、5E6L和HaCat細胞上ITF受體進行放射性結合分析,并通過Scatchard線性回歸分析得到IEC-6細胞最大結合容量Bmax=62.713×106結合位點/細胞,親和常數KD=4.3478×10-10mol/L;HT-29細胞最大結合容量Bmax=61.1583×106結合位點/細胞,親和常數KD

8、=0.8849×10-10mol/L;5E6L細胞最大結合容量Bmax=184.89×106結合位點/細胞,親和常數KD=3.448×10-10mol/L。根據所得到的KD值和Bmax分析,ITF與IEC-6、HT-29、5E6L細胞結合呈高親和力,但受體密度有所差異。表皮細胞HaCat與ITF結合呈低親和力。EGF對ITF受體及:ITF對EGF受體均無競爭抑制作用,EGFR阻斷肽對ITF與IEC-6細胞的結合并未受影響。 3.

9、激光共聚焦觀察發(fā)現,熒光標記的ITF首先聚集在細胞膜上,隨時間和濃度的增加,熒光標記的ITF逐漸向胞漿與胞核轉移。過量的ITF可明顯抑制熒光標記的ITF與細胞結合,熒光強度明顯降低。EGF和EGFR阻斷肽對,ITF在細胞膜上的熒光強度和向胞漿、胞核的轉移沒有影響。 結論: 1.重組表達的ITF產量約50mg/L,純度>95%,符合受體研究中對配體的要求。 2.確定了放射性配基結合實驗最佳反應條件,并證明腸上皮細胞

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