重組人腸三葉因子對腸上皮細胞移行能力的影響及其機制研究.pdf

1、目的：觀察重組人腸三葉因子(recombinant human intestinal trefoil factor, rhITF)對腸上皮細胞移行能力的影響并探討其作用機制。
　　方法：⑴實驗用藥：采用本實驗室重組表達的人腸三葉因子(rhITF)作為細胞刺激藥物，該重組蛋白純度達到98％以上，符合臨床前藥物研究標準。⑵細胞模型：以傳代培養(yǎng)的人結(jié)腸癌Caco-2細胞株為研究模型，購置于中科院細胞所，鑒定正確后進行傳代培養(yǎng)，再將傳至第

2、5-10代的細胞用于實驗。⑶實驗分組：根據(jù)實驗?zāi)康牟煌緦嶒灢捎枚鄠€分組模式，涉及的實驗組包括：陰性對照組和不同濃度的rhITF組；正常對照組、用藥3h組、6h組、12h組和24h組；正常對照組、rhITF組和rhITF+抑制劑組；陰性對照組、rhITF組和rhITF+抑制劑組。⑷培養(yǎng)條件：陰性對照組：DMEM培養(yǎng)液；rhITF組：撤掉血清后分別給予10μg/ml rhITF、25μg/ml rhITF和50μg/ml rhITF；正

3、常對照組：DMEM培養(yǎng)液+10%小牛血清；不同時相點組：固定rhITF濃度為50μg/ml，分為3h、6h、12h和24h組；正常對照組：同(2)；rhITF組：50μg/ml rhITF；rhITF+抑制劑組：50μg/ml rhITF+50μg/ml染料木黃酮；陰性對照組：DMEM培養(yǎng)液；撤掉血清后分別加入50μg/ml rhITF和50μg/ml rhITF+50μg/ml染料木黃酮。⑸檢測指標：細胞移行：采用Transwell法

4、，觀察腸上皮細胞移行能力的變化；黏附分子細胞定位和熒光表達：采用免疫熒光法檢測黏附分子β-Catenin和E-Cadherin在腸上皮細胞的定位和熒光表達情況；黏附分子含量：采用Western Blot法觀察黏附蛋白β-Catenin和E-Cadherin的蛋白表達變化；黏附分子磷酸化水平檢測：采用Western Blot法檢測磷酸化β-Catenin的蛋白表達變化。
　　結(jié)果：①rhITF促細胞移行能力隨其濃度的增加而增強。50

5、μg/ml rhITF組細胞數(shù)明顯高于陰性對照組、10μg/ml rhITF組和25μg/ml rhITF組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；25μg/ml rhITF組與陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而10μg/ml rhITF組與陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。②β-Catenin和E-Cadherin熒光表達和蛋白表達均受到rhITF抑制，與正常對照組、3h組、6h組和24h組比較，12h組

6、熒光表達和蛋白表達明顯減弱(P＜0.05)。③在rhITF的刺激下，與正常對照組、3h組、6h組和24h組比較，12h組磷酸化β-Catenin的蛋白表達明顯增強(P＜0.05)。④在rhITF和抑制劑（染料木黃酮）刺激下，rhITF組磷酸化β-Catenin的蛋白表達強于正常對照組和rhITF+抑制劑組(P<0.05)。⑤抑制β-Catenin磷酸化后能明顯降低rhITF促進細胞移行的能力。rhITF組細胞數(shù)顯著高于陰性對照組和rhI