腫瘤壞死因子α促進(jìn)大腸桿菌穿過(guò)腸上皮細(xì)胞屏障的機(jī)制研究.pdf

1、腸黏膜屏障是機(jī)體最重要的免疫防御屏障，將機(jī)體與腸道內(nèi)的外源性物質(zhì)隔離開(kāi)來(lái)，避免病原微生物的侵襲和抗原分子的損傷。腸黏膜屏障包括腸上皮細(xì)胞屏障、免疫屏障和微生物屏障，腸上皮細(xì)胞屏障是最重要的一道屏障，是腸黏膜屏障具有選擇性通透的基礎(chǔ)。目前研究發(fā)現(xiàn)多種疾病的發(fā)生(如炎癥性腸病、敗血癥、燒傷、終末期肝病、重癥胰腺炎等)都涉及到腸上皮細(xì)胞屏障通透性增高和細(xì)菌的定位轉(zhuǎn)移，并且在這些情況下，往往伴有細(xì)胞因子的參與，比較常見(jiàn)的血清腫瘤壞死因子α(TN

2、Fα)明顯升高，與腸上皮細(xì)胞屏障的損害程度呈正相關(guān)，抗TNFα抗體可以恢復(fù)受損的腸上皮細(xì)胞屏障。因此認(rèn)為T(mén)NFα是增加腸上皮細(xì)胞屏障通透性的重要因素，但TNFα是否也引起細(xì)菌定位轉(zhuǎn)移增加，是否是腸上皮細(xì)胞屏障通透性增加的結(jié)果，尚有待證實(shí)。 雖然目前已經(jīng)形成共識(shí)：TNFα可以增加腸上皮細(xì)胞屏障的通透性，但TNFα的具體作用機(jī)制和方式還存在爭(zhēng)議。早期認(rèn)為與TNFα引起的細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，近年來(lái)則傾向于TNFα引起腸上皮細(xì)胞屏障損傷是

3、非凋亡依賴性的，可能與PKC、NF-kappaB(nuclear factor-kappaB)、MLCK、MAPK等信號(hào)途徑有關(guān)。大部分有核細(xì)胞的表面都有TNF受體，TNFRⅠ和TNFRⅡ介導(dǎo)TNFα所引起的生物效應(yīng)各有不同，TNFα究竟是通過(guò)哪一種受體引起腸上皮細(xì)胞屏障通透性增高，還是兩種受體都參與其中，尚不十分清楚。因此我們應(yīng)用Caco-2細(xì)胞株建立體外腸上皮細(xì)胞屏障模型，觀察TNFα對(duì)腸上皮細(xì)胞屏障通透性、細(xì)菌穿過(guò)腸上皮屏障的數(shù)量

4、和腸上皮細(xì)胞間緊密連接的影響，并在此基礎(chǔ)上探討TNFα影響緊密連接的機(jī)制和可能的信號(hào)通路，以明確病理?xiàng)l件下，TNFα增加細(xì)菌定位轉(zhuǎn)移和腸上皮細(xì)胞屏障通透性的作用機(jī)制。 材料和方法： 1、體外腸上皮細(xì)胞屏障模型的建立 應(yīng)用Caco-2細(xì)胞株建立體外腸上皮細(xì)胞屏障模型，并應(yīng)用跨上皮細(xì)胞電阻(TEER)和熒光黃透過(guò)率兩種指標(biāo)檢測(cè)腸上皮細(xì)胞屏障的完整性。 2、TNFα對(duì)腸上皮細(xì)胞屏障通透性的影響 不同濃度

5、TNFα(0、10、50、100ng/ml)作用24h或TNFα(100ng/ml)作用不同時(shí)間(2、4、8、24h)，觀察TNFα作用前后所引起的Caco-2細(xì)胞屏障跨上皮細(xì)胞電阻(TEER)的改變，以及TNFα對(duì)熒光黃透過(guò)率的影響。 3、TNFα對(duì)大腸桿菌EcoliK1.E44穿越腸上皮細(xì)胞屏障的影響 不同濃度TNFα(0、10、50、100ng/ml)作用24h或TNFα(100ng/ml)作用不同時(shí)間(2、4、8

6、、24h)，觀察TNFα對(duì)耐利福平大腸桿菌EcoliK1.E44穿越腸上皮細(xì)胞屏障數(shù)量的影響。 4、TNFα對(duì)腸上皮細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)的影響 應(yīng)用透射電鏡觀察TNFα(0、50、100ng/ml)作用于Caco-2細(xì)胞24h后所引起的細(xì)胞間緊密連接超微結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)的改變。 5、TNFα對(duì)腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1表達(dá)和定位的影響 應(yīng)用免疫熒光、蛋白印跡雜交(Westernblot)和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢

7、測(cè)不同濃度的TNFα(0、10、50、100ng/ml)作用于Caco-2細(xì)胞24h后所引起的腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1定位和表達(dá)的變化情況。 6、抗TNFRⅠ、RⅡ抗體阻斷TNFα對(duì)腸上皮細(xì)胞屏障的影響 加入TNFα100ng/ml作用前30min先加入抗TNFRⅠ、RⅡ單克隆抗體(2μg/ml)封閉細(xì)胞表面的TNF受體，在TNFα作用24h后，分別檢測(cè)TEER、熒光黃透過(guò)率、大腸桿菌EcoliK1.E44穿越腸上

8、皮細(xì)胞屏障的活菌數(shù)量；并應(yīng)用免疫熒光和Westernblot技術(shù)檢測(cè)抗TNFRⅠ、RⅡ抗體封閉細(xì)胞表面的TNF受體后，TNFα對(duì)腸上皮屏障的作用。 結(jié)果： 1、TNFα增加腸上皮細(xì)胞屏障的通透性 與對(duì)照組相比，50ng/mlTNFα可明顯降低腸上皮細(xì)胞屏障的TEER(p＜0.001)，增加熒光黃的透過(guò)率(p＜0.0005)，100ng/mlTNFα這種作用更加明顯(p＜0.0005)。TNFα100ng/ml作用

9、4h后，TEER值即開(kāi)始下降(P＜0.05)，熒光黃透過(guò)率開(kāi)始升高(p＜0.001)，24h這種作用達(dá)到最強(qiáng)(p＜0.005)。 2、TNFα增加大腸桿菌EcoliK1.E44穿越腸上皮細(xì)胞屏障的數(shù)量 TNFα作用于Caco-2細(xì)胞單層24h，使細(xì)菌定位轉(zhuǎn)移數(shù)量明顯，且轉(zhuǎn)移的活菌數(shù)量與TNFα劑量相關(guān)。TNFα(100ng/ml)時(shí)為6.83±0.16log10CFU/ml，與沒(méi)有TNFα刺激時(shí)定位轉(zhuǎn)移活細(xì)菌數(shù)相比增加了

10、近千倍(2.05±0.18log10CFU/ml，p＜0.001)。 3、大腸桿菌EcoliK1.E44穿越腸上皮細(xì)胞屏障的數(shù)量 增加與腸上皮細(xì)胞屏障的通透性增加相關(guān)TNFα(100ng/ml)作用于Caco-2細(xì)胞的24h觀察時(shí)間內(nèi)，作用時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)TEER、細(xì)菌定位轉(zhuǎn)移和熒光黃透過(guò)率的影響就越大，表現(xiàn)出時(shí)間依賴性。分析兩兩因素之間的相互關(guān)系時(shí)，熒光黃透過(guò)率和穿過(guò)Caco-2細(xì)胞單層的活細(xì)菌數(shù)量之間(r=0.991)、

11、TEER和熒光黃透過(guò)率之間(r=-0.998)以及TEER和穿過(guò)Caco-2細(xì)胞單層的活細(xì)菌數(shù)量之間(r=-0.996)呈現(xiàn)直線相關(guān)性(p均＜0.001)，提示這三個(gè)因素在時(shí)間上的變化是相一致的。 4、TNFα破壞腸上皮細(xì)胞間的緊密連接 在掃描電鏡下觀察，正常CaCo-2細(xì)胞，緊密連接結(jié)構(gòu)完整，呈高電子密度的致密的帶狀結(jié)構(gòu)。加入TNFα100ng/ml作用24h后，緊密連接結(jié)構(gòu)電子密度降低，緊密連接變短，細(xì)胞縫隙增寬。

12、 5、TNFα引起腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1的定位異常 正常Caco-2細(xì)胞，ZO-1蛋白沿細(xì)胞膜分布；加入TNFα10ng/ml，ZO-1蛋白呈鋸齒狀分布，并且熒光信號(hào)減弱；加入TNFα100ng/ml，熒光信號(hào)進(jìn)一步減弱，并且在胞漿內(nèi)可見(jiàn)陽(yáng)性染色，相鄰細(xì)胞間縫隙增寬。 6、TNFα引起ZO-1蛋白表達(dá)減少 與對(duì)照組比較，加入TNFα100ng/ml作用24h后，ZO-1蛋白的相對(duì)含量明顯減少(0.1

13、4±0.02vs0.37±0.05，p＜0.05)。ZO-1蛋白的表達(dá)還受到TNFα作用時(shí)間的影響，有時(shí)間依賴性。 7、TNFα不影響ZO-1mRNA的表達(dá) 與對(duì)照組比較，不同濃度的TNFα或TNFα(100ng/ml)作用不同時(shí)間，沒(méi)有引起ZO-1mRNA的明顯改變(p=0.85)。 8、抗TNFRⅠ、RⅡ抗體阻斷TNFα增加腸上皮細(xì)胞屏障通透性的作用 與TNFα(100ng/ml)相比較，抗TNFRⅠ

14、、RⅡ抗體(2μg/ml)預(yù)先封閉細(xì)胞表面的受體后，Caco-2細(xì)胞單層TEER％上升(76.9±11.88％、72.79±5.21％vs40.3±7.2％，p＜0.001)。熒光黃透過(guò)率明顯減少(12.6±0.81％和14.2±0.83％vs31.5±3.93％，p＜0.0001)。 9、抗TNFRⅠ、TNFRⅡ抗體減輕TNFα促進(jìn)大腸桿菌腸EcoliK1.E44穿越腸上皮細(xì)胞屏障的作用 與TNFα(100ng/ml)

15、相比較，抗TNFRⅠ、RⅡ抗體(2μg/ml)預(yù)先封閉細(xì)胞表面的受體后，細(xì)菌轉(zhuǎn)移數(shù)量明顯下降(3.51±0.49log10CFU/ml、3.82±0.46log10CFU/mlvs6.83±0.16log10CFU/ml，p＜0.0001)。 10、抗TNFRⅠ、TNFRⅡ抗體阻斷TNFα下調(diào)ZO-1蛋白表達(dá)的作用 與TNFα(100ng/ml)相比較，封閉細(xì)胞表面TNFRⅠ、TNFRⅡ受體后ZO-1蛋白的表達(dá)增加(0.

16、28±0.03、0.32±0.06vs0.21±0.015，p≤0.05)。 結(jié)論： 1、TNFα增加腸上皮細(xì)胞屏障的通透性。 2、TNFα增加大腸桿菌EcoliK1.E44穿越腸上皮細(xì)胞屏障的數(shù)量。 3、大腸桿菌EcoliK1.E44穿越腸上皮細(xì)胞屏障的數(shù)量增加與腸上皮屏障通透性相關(guān)，提示大腸桿菌的定位轉(zhuǎn)移與腸上皮細(xì)胞的通透性增加有關(guān)。 4、TNFα破壞腸上皮細(xì)胞間的緊密連接，這是其增加腸上皮細(xì)