多巴胺受體信號通路對前皮質(zhì)神經(jīng)元樹突重塑的調(diào)控.pdf

1、吸毒是全世界廣泛關(guān)注的問題,毒品的泛濫直接危害人民的身心健康,并給經(jīng)濟發(fā)展和社會進步帶來巨大威脅。吸毒最大的危害在于其成癮性。毒品成癮(daug addiction)指不擇手段、不計后果地強制性獲取、使用某種毒品。毒品成癮一旦形成,即可能成為一種終身性狀態(tài),成癮者不擇手段地獲取毒品,具有極高的復發(fā)性,甚至在戒斷多年后仍有可能復發(fā),造成很嚴重的社會問題。毒品成癮的形成是一個循序漸進的過程,毒品成癮過程中,機體在分子、細胞水平發(fā)生代償性變化

2、,這些包括基因表達和神經(jīng)元形態(tài)上的改變,會影響神經(jīng)元功能和神經(jīng)通路,進而導致行為學上的異常。
　　 可卡因成癮的過程中,大腦多個部位的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變,其中重要的是神經(jīng)元樹突發(fā)生了重塑(dendrite remodeling),這是可卡因(cocaine)成癮發(fā)生的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。許多研究報道多巴胺信號通路在可卡因介導的神經(jīng)元樹突重塑中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用,并且有研究發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)D1和D3多巴胺受體對下游的長期誘導的靶基因Neogenin

3、和SynaptotagminⅦ起到相反的調(diào)節(jié)作用；這些基因的長期變化,參與神經(jīng)元可塑性的形成,并進一步參與毒品給藥后的行為學變化。在典型的神經(jīng)元中,來自胞體的初級樹突重復分支建立起一個有特色的樹突樹(dtendritic tree),樹突分支會生出微小的突起,稱之為樹突棘(spine),它是大多數(shù)興奮性突觸接受信息的位點,而相應的抑制性突觸主要分布在樹突樹的主干上,樹突結(jié)構(gòu)的改變會導致突觸信息的變化。Robinson等報道重復施用可卡因

4、會造成紋狀體伏核區(qū)(nucleus accumbens,NAc)中度棘神經(jīng)元(medium spiny neuron,MSN)樹突增長、分支增加和樹突棘的密度增加,而且這種形態(tài)變化會在停藥后至少維持一個月。結(jié)構(gòu)的改變和學習、長時程增強均有密切聯(lián)系。結(jié)構(gòu)的改變會帶來神經(jīng)環(huán)路的改變、影響神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞,更重要的是帶來突觸組織形式的改變。
　　 多種信號分子參與了神經(jīng)元的可塑性變化,多巴胺受體(dopamine receptor)、N

5、MDA(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受體、ERK(extracell-ular signal-regulatedkinase,ERK)以及Rho蛋白家族等等都可能在其中有重要的調(diào)節(jié)作用,但是它們?nèi)绾握{(diào)節(jié)可卡因介導的樹突重構(gòu)的分子機制尚存在很多值得我們研究的地方。我們的策略是通過特異性阻斷或者特異性激活上述信號通路,以探究該信號通路是否參與多巴胺誘導的神經(jīng)元樹突重構(gòu)以及其可能的下游信號分子,進而揭示可卡因成癮過程中

6、多巴胺信號通路誘導的神經(jīng)元樹突發(fā)生重塑可能的分子機制。
　　 本課題首先構(gòu)建了Rho蛋白家族中兩個亞型Rac1和RhoA的顯性負效突變體(Rac1N17和RhoAN19)和組成型活性突變體(Rac1L61和RhoAL63)的慢病毒,通過感染原代培養(yǎng)的前皮質(zhì)神經(jīng)元細胞(Profrontal Cortex Neurons,PFC)驗證Rac1和RhoA-GTPasess的生物學活性；進而,在原代培養(yǎng)的前皮質(zhì)神經(jīng)元細胞中重復給與多巴胺

7、,在最后一次刺激4 d后,固定細胞做免疫熒光,結(jié)果顯示:多巴胺重復刺激下前皮質(zhì)區(qū)域椎體神經(jīng)元細胞樹突分支總數(shù)和樹突棘數(shù)目增多,神經(jīng)突觸密度增加。進一步,我們采用D1和D3受體的抑制劑與激動劑、Rac1和RhoA的顯性負效突變體和組成型活性突變體的慢病毒及Rac1和RhoA的抑制劑,通過特異性的阻斷或者激活相應的信號分子,以探究該信號分子是否參與多巴胺誘導的神經(jīng)元樹突重構(gòu)以及在樹突重構(gòu)中的作用。本研究主要結(jié)果如下:
　　 1.構(gòu)建

8、了Rho家族重組質(zhì)粒Plenti6/v5-Rac1N17,Plenti6/v5-Rac1L61,Plenti6/v5-RhoAL63,Plenti6/v5-RhoAN19,并且包裝制備了相應的慢病毒,感染原代培養(yǎng)的前皮質(zhì)神經(jīng)元細胞后,采用G-LISATM系統(tǒng)對慢病毒Plenti6/v5-Rac1N17,Plenti6/v5-Rac1L61,Plenti6/v5-RhoAN19,Plenti6/v5-RhoA-L63進行了功能活性鑒定,經(jīng)

9、表皮生長因子(Epidermal Growth Factor,EGF)(Rac1-GTPase測定)刺激或者溶血磷脂酸(Lysophosphatidic acid,LPS)(RhoA-GTPase測定)刺激2 min后收集細胞檢測相應蛋白活性,結(jié)果顯示:與Plenti6/v5-EGFP組相比,Plenti6/v5-Rac1N17組Rac1活性降低了29.3％,而Plenti6/v5-Rac1L61組Rac1活性則增高了2.3倍；與Ple

10、nti6/v5-EGFP組相比,Plenti6/v5-RhoA1N19組RhoA活性降低了42.8％,而Plenti6/v5-RhoA1L63組RhoA活性則增高了1.7倍；結(jié)果都具有顯著的統(tǒng)計學差異,提示構(gòu)建的慢病毒具備了特定的生物學活性。
　　 2.建立了多巴胺重復刺激前皮質(zhì)神經(jīng)元細胞模型:在原代培養(yǎng)前皮質(zhì)神經(jīng)元細胞的第11 d,13 d,15 d應用1 μmol/L多巴胺重復刺激。并應用該模型探討了多巴胺重復刺激對于神經(jīng)元

11、細胞的樹突分支數(shù)目、樹突棘數(shù)目和神經(jīng)突觸密度的影響。結(jié)果顯示:多巴胺重復刺激后神經(jīng)元細胞的樹突分支數(shù)目和樹突棘數(shù)目增多、神經(jīng)突觸密度增加,其結(jié)果與PBS對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 3.應用D1多巴胺受體抑制劑SCH23390(10 μmol/L)、D1多巴胺受體激動劑SKF81297(1 μmol/L)和D3多巴胺受體抑制劑NGB2904(50 μmol/L)以探究D1多巴胺受體和D3多巴胺受體在調(diào)節(jié)PFC細胞重塑中的

12、作用。在每次加多巴胺刺激前5 min加SCH23390,10 min加NGB2904,制備多巴胺重復刺激模型；同時單獨應用D1多巴胺受體激動劑SKF81297刺激15 min,固定細胞做免疫熒光,結(jié)果顯示:在前皮質(zhì)區(qū)域先應用D1多巴胺受體抑制劑SCH23390后,多巴胺重復刺激引起的神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變會被顯著抑制,即:神經(jīng)元細胞樹突數(shù)目和樹突棘數(shù)目減少,神經(jīng)突觸密度降低；而SKF81297刺激后神經(jīng)元樹突數(shù)目、樹突棘數(shù)目、神經(jīng)突觸密度

13、都顯著增加,與多巴胺重復刺激類似,提示D1多巴胺受體在多巴胺重復刺激誘導神經(jīng)元樹突重構(gòu)中發(fā)揮正性調(diào)控作用。而先應用D3多巴胺受體抑制劑NGB2904后,神經(jīng)元細胞樹突數(shù)目和樹突棘數(shù)目相比單純的多巴胺組有所增高,差異具有統(tǒng)計學意義,提示D3多巴胺受體在神經(jīng)元樹突重塑中發(fā)揮負性的調(diào)控作用,即D1多巴胺受體和D3多巴胺受體在神經(jīng)元樹突重塑中發(fā)揮重要的調(diào)控作用,并且兩者的調(diào)控作用是相反的。
　　 4.應用Rac1和RhoA的顯性負效突變

14、體的慢病毒在前皮質(zhì)神經(jīng)元細胞培養(yǎng)的第7d感染細胞,次日換去全液,同樣給與多巴胺重復刺激,探討Rac1和RhoA蛋白是否參與了慢性多巴胺刺激誘導的神經(jīng)元樹突重塑以及其所發(fā)揮的作用。固定細胞做免疫熒光,結(jié)果顯示:在前皮質(zhì)區(qū)域,感染Rac1N17顯著抑制了多巴胺重復刺激引起的神經(jīng)元樹突分支數(shù)目和樹突棘數(shù)目的增多以及突觸密度的增加,差異具有統(tǒng)計學意義,這提示Rac1在多巴胺刺激誘導的神經(jīng)元樹突重構(gòu)過程中發(fā)揮重要的正性調(diào)控作用；相反感染RhoAN

15、19慢病毒后增強了多巴胺刺激引起的神經(jīng)元樹突分支數(shù)目、樹突棘數(shù)目和突觸密度的增加,差異具有統(tǒng)計學意義,提示RhoA在多巴胺介導的神經(jīng)元樹突重塑中發(fā)揮負性調(diào)控作用。
　　 5.同樣應用Rac1的抑制劑NSC23766以及RhoA的抑制劑Y27632以探究Rac1和RhoA是否參與了多巴胺重復刺激誘導的神經(jīng)元樹突重塑。該組前皮質(zhì)細胞在每次加多巴胺刺激前3 min加NSC23766(100 μmol/L)或者Y27632(100 μm

16、ol/L)。細胞固定后進行免疫熒光染色,結(jié)果顯示:在前皮質(zhì)區(qū)域,NSC23766顯著逆轉(zhuǎn)多巴胺重復刺激引起的樹突分支數(shù)目、樹突棘數(shù)目增多和神經(jīng)突觸密度增加,這與病毒感染的結(jié)果相同,差異具有統(tǒng)計學意義；而Y27632組與多巴胺組比較則尚無統(tǒng)計學差異。
　　 通過上述研究,我們得出以下結(jié)論:一、成功構(gòu)建了Rac1和RhoA蛋白的顯性負效突變體和組成型活性突變體的慢病毒,并驗證了相應的生物學活性,為下一步研究奠定了基礎(chǔ)。二、發(fā)現(xiàn)多巴胺

17、重復刺激介導神經(jīng)元細胞樹突分支數(shù)目、樹突棘數(shù)目增多和神經(jīng)突觸數(shù)目增加。三、多巴胺誘導的樹突重塑過程中,D1、D3多巴胺受體發(fā)揮了相反的調(diào)控作用,刺激多巴胺受體誘導的神經(jīng)元樹突增長、分支增加和樹突棘密度增加主要是通過D1多巴胺受體,而D3多巴胺受體主要起抑制作用。四、多巴胺誘導的樹突重塑過程中,Rac1和RhoA蛋白參與介導神經(jīng)元樹突重塑,并且Rac1促進樹突分支數(shù)目、樹突棘數(shù)目的增多以及神經(jīng)突觸密度的增加,而RhoA則發(fā)揮了相反的調(diào)節(jié)作

18、用。
　　 綜上所述,本研究成功構(gòu)建了Rho蛋白家族中Rac1和RhoA的顯性負效突變體和組成型活性突變體,制備了多巴胺重復刺激細胞模型,采用一系列特異性抑制劑、激動劑及突變體,通過阻斷多巴胺受體通路、Rho家族信號通路,探究多巴胺誘導的神經(jīng)元樹突重構(gòu)可能的分子機制。結(jié)果表明,D1、D3多巴胺受體和Rac1、RhoA信號通路均參與了多巴胺誘導的神經(jīng)元樹突重塑,并且D1多巴胺受體和Rac1蛋白發(fā)揮正性調(diào)節(jié)作用,而D3多巴胺受體和R