慢性睡眠剝奪對大鼠前額皮質(zhì)多巴胺D1受體信號通路的影響.pdf

1、睡眠剝奪(SD)是一種普遍存在的社會現(xiàn)象，長時間SD將會嚴(yán)重影響機體的行為、學(xué)習(xí)和工作。與短期的急性睡眠剝奪(ASD)相比，長期的慢性睡眠剝奪(CSD)對高級神經(jīng)功能（學(xué)習(xí)記憶、認(rèn)知和決策等）和工作效率的影響更加嚴(yán)重。前人研究表明PFC在CSD導(dǎo)致的神經(jīng)行為學(xué)改變中發(fā)揮著重要作用，在我們的前期研究中發(fā)現(xiàn)CSD可導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和自主活動能力的降低，同時PFC內(nèi)多巴胺(DA)含量下降，多巴胺D1受體(D1R) mRNA和蛋白表達水平降

2、低，PFC深層神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)受損，而D1R激動劑SKF38393干預(yù)后，可改善這一現(xiàn)象。這些實驗表明PFC內(nèi)DA及其D1R可能參與調(diào)節(jié)了CSD導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶能力以及探索能力下降的過程。
　　 D1R作為一種G蛋白偶聯(lián)受體，可通過AC-cAMP-PKA通路、磷酸肌醇通路和有絲分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)通路調(diào)控核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子cAMP反應(yīng)原件結(jié)合蛋白(CREB)的表達，進而調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞的功能。而在CSD導(dǎo)致PFC功能障礙以及激動D

3、1R改善PFC的過程中，D1R主要通過哪條信號通路調(diào)節(jié)神經(jīng)功能？其中關(guān)鍵信號分子是什么？是否還存在其他調(diào)節(jié)途徑？均有待于進一步研究探討。因此，我們通過基因表達譜芯片檢測了大鼠PFC內(nèi)全部基因的轉(zhuǎn)錄表達水平，分析尋找CSD導(dǎo)致PFC結(jié)構(gòu)和功能改變的新的信號通路及其關(guān)鍵信號分子。通過RT-PCR和Western blot技術(shù)分別驗證了D1R信號通路中關(guān)鍵信號分子的基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達水平。闡明D1R調(diào)控CSD導(dǎo)致PFC結(jié)構(gòu)和功能受損過程的

4、主要通路和信號分子。
　　 第一部分慢性睡眠剝奪對前額皮質(zhì)基因表達譜的影響
　　 目的:觀察CSD對PFC內(nèi)各個基因轉(zhuǎn)錄表達水平的影響，探尋調(diào)節(jié)CSD導(dǎo)致PFC結(jié)構(gòu)和功能改變的關(guān)鍵信號分子及其相關(guān)的功能途徑。
　　 材料與方法:選用成年健康雄性Sprague Dawle大鼠60只，經(jīng)體重、Morris水迷宮訓(xùn)練和小平臺站立訓(xùn)練篩選出45只，并隨機分為三組:大平臺環(huán)境處理對照(TC)組，慢性睡眠剝奪(CSD)組和激

5、動劑干預(yù)(SKF)組，每組樣本量為15。TC組大鼠放入水環(huán)境相同的大平臺對照箱內(nèi)保證其正常睡眠，其他兩組采用改良多平臺水環(huán)境剝奪法(MMPM)對大鼠進行每天18h(16:00-10:00)快速眼動睡眠（REM）剝奪，持續(xù)21d。從剝奪第15d開始，每天上午(10:00-11:00)，TC組與CSD組每只大鼠腹腔注射1mL PBS對照溶液，SKF組每只大鼠腹腔注射1mL多巴胺D1R特異激動劑SKF38393（1mg/kg），連續(xù)給藥7d。

6、睡眠剝奪結(jié)束后，快速取腦，冰上分離雙側(cè)PFC，置于-80℃凍存?zhèn)溆?。每組隨機選取4個樣本（其中3個用于檢測，1個備用），通過表達譜基因芯片檢測PFC內(nèi)各個基因的轉(zhuǎn)錄表達水平。然后挑選19個基因，取用于芯片檢測的3個樣本的剩余RNA，通過實時定量PCR技術(shù)(RT-PCR/qPCR)驗證芯片檢測質(zhì)量。
　　 結(jié)果:芯片驗證擬合度為r2=0.85，芯片檢測合格。篩選差異基因(p＜0.05且FC≥1.5)，各組表達情況為:
　　

7、 與TC組相比，CSD組存在208個差異表達基因，其中88個基因表達下調(diào)，120基因表達上調(diào);對兩組差異基因進行GO基因功能分類，富集度檢驗p＜0.05的功能分類情況為:三級功能分類有29個，二級功能分類有5個;兩組差異基因所關(guān)聯(lián)的信號通路中，富集度檢驗p＜0.05的信號通路有22個，其中主要包括MAPK、各種代謝調(diào)節(jié)、晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)等通路。
　　 與CSD組相比，SKF組存在115個差異基因，其中57個表達下調(diào)，58個

8、表達上調(diào)。與TC組相比，SKF組存在126個差異基因，其中59個表達水平下降，67個表達水平升高。
　　 此外，與CSD組相比，TC組與SKF組具有Hspb1，S100a9，Homer1等14個相同表達趨勢的差異基因。與TC組相比，CSD組與SKF組具有Per2、Chm、Cm13等15個相同表達趨勢的差異基因。
　　 討論:CSD組與TC組的差異基因最多，達到208個，CSD損傷PFC結(jié)構(gòu)導(dǎo)致高級神經(jīng)功能障礙的過程，可能

9、是通過影響這些基因的表達來實現(xiàn)的。這些差異基因可能與發(fā)育、細胞殺傷、免疫系統(tǒng)和各種代謝調(diào)節(jié)等功能或途徑的調(diào)控有關(guān)。值得注意的是，D1R激動劑SKF38393的干預(yù)，使Hspb1，S100a9，Homer1等14個受CSD影響的基因恢復(fù)到了正常水平，這說明在激動D1R改善CSD對PFC結(jié)構(gòu)和功能損傷的過程中，可能是通過這些基因發(fā)揮了主要的調(diào)節(jié)作用。這些基因多與鈣離子通路、MAPK通路、應(yīng)激以及凋亡等功能途徑有關(guān)，因而，除了D1R介導(dǎo)的信號

10、通路外，SKF38393可能通過這些基因及其相關(guān)途徑來影響CSD對PFC結(jié)構(gòu)和功能改變。
　　 此外，激動D1R并未完全的反轉(zhuǎn)CSD對PFC內(nèi)基因表達的影響作用，比如Per2、Chm、Cm13等15個基因的表達并沒有受到SKF38393的影響，所以還可能存在多巴胺受體系統(tǒng)以外的其他損傷機制。
　　 第二部分慢性睡眠剝奪對前額皮質(zhì)內(nèi)D1R信號通路的影響
　　 目的:研究CSD對PFC內(nèi)D1R所介導(dǎo)的信號通路的影響，

11、闡明D1R調(diào)控CSD導(dǎo)致PFC結(jié)構(gòu)功能受損過程的主要途徑和信號分子。
　　 材料與方法:分析芯片結(jié)果中多巴胺D1R所介導(dǎo)通路內(nèi)的已知信號因子基因的表達水平變化;取每組6個樣本，通過RT-PCR技術(shù)驗證與D1R信號通路相關(guān)的17個信號分子的基因表達水平。取每組4個樣本，通過Western blot技術(shù)檢測與D1R信號通路相關(guān)的7個調(diào)節(jié)分子的蛋白表達水平和磷酸化水平。
　　 結(jié)果:芯片結(jié)果指出:CSD導(dǎo)致多巴胺D1R所介導(dǎo)通

12、路內(nèi)的已知信號分子中有15個基因發(fā)生改變（p＜0.05或FC≥1.5），其中Camk4和Camk1g差異明顯(p＜0.05且FC≥1.5)，與CSD組相比，SKF組中Rap1a、Rasgrf1和Creb三個基因恢復(fù)到正常水平(FC≥1.5)。
　　 RT-PCR結(jié)果顯示:與TC組相比，CSD組內(nèi)Plcb1，Camk4，Camk1g，Rap1a，Rap1b和Erk1的表達顯著下降，而與CSD組相比，SKF組內(nèi)Plcb1，Camk4

13、，Drd1a，Prkaca，Darpp32，Pkcγ，Rap1a和Rap1b的表達顯著增高。
　　 Western blot結(jié)果顯示:在總蛋白水平上， CSD組內(nèi)PLCβ和NMDAR1表達顯著性降低，而在SKF組中PLCβ，CaMKⅣ和CREB的表達顯著升高;在磷酸化水平上，CSD組PLCγ，IP3R1，CaMKⅣ，NMDAR1和CREB的表達顯著性降低，而SKF組的7個被檢測分子的表達均顯著性升高。
　　 討論:本教研

14、室前期研究表明CSD導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶能力下降與DA及其D1R調(diào)節(jié)受阻致使PFC神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能損害有關(guān)。而D1R可通過AC-cAMP-PKA，MAPK和磷酸肌醇三條信號通路調(diào)節(jié)核內(nèi)CREB等轉(zhuǎn)錄因子的表達。
　　 由芯片和PCR對基因的檢測發(fā)現(xiàn)，在基因的轉(zhuǎn)錄水平上，CSD沒有顯著改變PKA通路中關(guān)鍵分子的基因表達，而芯片差異基因的富集檢驗推測出CSD對大鼠PFC內(nèi)MAPK通路的調(diào)節(jié)產(chǎn)生重要影響，經(jīng)檢驗推測MAPK通路中由小G蛋白R

15、ap和Ras調(diào)節(jié)的ERK1/2通路可能在CSD導(dǎo)致PFC改變和之后恢復(fù)的過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。研究還發(fā)現(xiàn)CSD顯著改變了磷酸肌醇通路中磷脂酶C(PLC)，肌醇三磷酸受體(IP3R)和鈣/鈣調(diào)素依賴的蛋白激酶(CaMKs)等分子的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白磷酸化水平，這些分子的基因與胞內(nèi)鈣離子水平的調(diào)節(jié)有關(guān)，而D1R激動劑SKF38393的干預(yù)可反轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。綜上所述，可推測在CSD損害PFC組織結(jié)構(gòu)和功能的過程中，PFC內(nèi)由D1R介導(dǎo)的MAPK通