肥胖Zucker大鼠腸系膜動脈多巴胺D1受體介導(dǎo)的血管舒張功能受損及其機制.pdf

1、研究背景和目的:
　　肥胖和高血壓是代謝綜合癥(metabolic syndrome,MS)的兩個重要組成部分,通常在同一個體中并存,促進了心血管的發(fā)生與發(fā)展[1][2]。關(guān)于肥胖引起的高血壓病因尚未完全清楚,研究發(fā)現(xiàn)肥胖個體胰島素抵抗以及高胰島素血癥是其中一個重要因素[1][2][3][4]。胰島素要對交感神經(jīng)系統(tǒng)的激活[5]、血管平滑肌增值[6]、腎臟水鈉潴留[7]、對前列腺素合成的抑制效應(yīng)[8]等都可以參與肥胖相關(guān)的高血壓的

2、發(fā)生和發(fā)展。
　　多巴胺是一種眾所周知的中樞神經(jīng)遞質(zhì)。其在腎臟和腎上腺功能、機體水鹽平衡和血壓方面具有重要調(diào)節(jié)作用。根據(jù)結(jié)構(gòu)和藥理學(xué)特性不同,多巴胺受體分為兩個亞群:D1類、D2類受體。D1類受體由D1和D5組成。D2類受體由D2、D3和D4組成, D1受體是多巴胺家族中最主要的亞型。以往的研究結(jié)果顯示腎臟多巴胺系統(tǒng)功能受損參與了高血壓的發(fā)生和發(fā)展[9][10]。受損的中樞系統(tǒng)多巴胺D2受體通過增加食物的攝入量從而參與機體肥胖的發(fā)

3、生[11][12]。既往研究還發(fā)現(xiàn)肥胖Zucker大鼠中D1受體排鈉利尿功能下降[1][2]。雖然腎臟在血壓長期調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[3],血壓增高的過程中同樣伴隨著血管阻力的增加[4]。在阻力血管中,D1類受體在中膜中表達而D2類受體主要在內(nèi)膜和中外膜過渡帶表達。既往研究表明血管D1, D2,和 D5受體表達下降參與了衰老相關(guān)的血壓增高的過程[5]。然而,在肥胖Zucker大鼠這一高血壓模型中血管上D1受體的功能是否受損還沒有相關(guān)的報道

4、,而這正是本研究的目的。
　　方法:
　　第一部分:12-14周肥胖Zucker大鼠和瘦 Zucker大鼠腸系膜三級動脈 D1受體介導(dǎo)的血管舒張功能的的比較
　　目前對微血管(直徑<200um)張力的記錄國內(nèi)外均采用小血管肌動描記儀進行精確測定;因D1受體的表達量下降和基礎(chǔ)磷酸化水平增加均可以削弱D1受體的功能,我們分別采用蛋白免疫印跡和免疫共沉淀的方法對D1受體的表達和磷酸化水平進行定量。
　　1、取6只12-

5、14周胖、瘦 Zucker大鼠氣管切開、左頸動脈插管用于監(jiān)測血壓。禁食12小時后用羅氏血糖監(jiān)測儀測量血漿葡萄糖濃度,血漿胰島素水平通過酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)法測定。
　　2、采用等距小血管肌動描記儀(型號DMT610,丹麥)實時監(jiān)測腸系膜三級動脈的張力。D1受體的表達和磷酸化分別通過蛋白免疫印跡(Westen Blot,WB)和免疫共沉淀(Co-immu

6、noprecipitation,IP)進行定量。
　　第二部分:高胰島素血癥和高糖血癥在肥胖Zucker大鼠腸系膜三級動脈D1受體介導(dǎo)的血管舒張功能受損中的作用
　　肥胖Zucker大鼠體內(nèi)存在明顯的胰島素抵抗、高胰島素血癥和伴隨年齡逐漸增加的血糖水平,為了探求肥胖Zucker大鼠體內(nèi)的高胰島素和高糖是否參與了D1受體受損的過程,我們用經(jīng)典的PPAR-γ受體激動劑羅格列酮(Rosiglitazone,ROG)長期灌胃的方法,

7、觀察肥胖Zucker大鼠血漿胰島素和血糖水平是否下降、腸系膜D1受體功能是否有所恢復(fù);另外我們用瘦Zucker大鼠建立了高胰島素和高糖動物模型。營養(yǎng)誘發(fā)動物模型(食物喂養(yǎng)法)是胰島素抵抗動物模型建立最常用的方法,其中高脂飼料(high-fat diet, HFD)為誘導(dǎo)該模型的常見飼料;鏈霉素(Streptomycin,STZ)65mg/kg一次性腹腔注射是快速建立高糖動物模型的常用方法。
　　1、肥胖的Zucker大鼠(6至8周

8、齡)分為羅格列酮組(灌胃,10毫克/公斤/天,6周)和溶劑對照組,到大鼠長至12-14周齡時按照前述方法測量血壓、血漿胰島素、血糖以及腸系膜三級血管D1受體血管舒張功能,并比較給藥組和對照組D1受體的表達和基礎(chǔ)磷酸化水平的差異。
　　2、將瘦 Zucker大鼠(8到10周齡)分為三組,喂食高脂食物(脂肪熱量占50％)誘發(fā)高胰島素血癥組、一次性腹腔注射鏈霉素(65毫克/公斤)誘發(fā)高血糖組和溶劑對照組。到大鼠長至12-14周齡時按照前

9、述方法測量血壓、血漿胰島素、血糖以及腸系膜三級血管D1受體血管舒張功能,并比較三組之間D1受體的表達和基礎(chǔ)磷酸化水平的差異。
　　第三部分:體外實驗予以高胰島素和高糖刺激大鼠胚胎胸主動脈平滑肌細胞,觀察其D1受體表達和磷酸化的變化
　　前面實驗我們已經(jīng)證實去掉內(nèi)皮前后D1受體介導(dǎo)的舒張血管功能不變,血管中膜平滑肌上的D1受體介導(dǎo)了fenoldopam的舒血管效應(yīng),故此階段實驗我們外源性地加入濃度梯度的胰島素和葡萄糖觀察兩者對

10、平滑肌細胞D1受體表達和磷酸化的影響,以進一步證實前面體內(nèi)實驗的結(jié)果。由于絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)是胰島素重要的下游信號通道分子,故加入MAPK抑制劑后觀察高胰島素對D1受體表達和磷酸化的影響。
　　結(jié)果:
　　第一部分:12-14周肥胖Zucker大鼠和瘦 Zucker大鼠腸系膜三級動脈 D1受體介導(dǎo)的血管舒張功能的的比較
　　1、肥胖Zucke

11、r大鼠體重、空腹血漿葡萄糖及胰島素、血壓均高于同齡的瘦Zucker大鼠。
　　2、D1受體激動劑非諾多泮(Fenoldopam)濃度依賴性地(10-7M to10-5M)舒張瘦Zucker大鼠腸系膜三級動脈。去掉內(nèi)皮均不影響fenoldopam對胖、瘦Zucker大鼠的舒張血管的效應(yīng)。
　　3、特異性的D1受體拮抗劑SCH23390可以拮抗fenoldopam對胖、瘦Zucker大鼠血管的舒張效應(yīng)。非諾多泮在胖Zucker大

12、鼠腸系膜三級動脈中介導(dǎo)的受損的舒張作用不是因為血管平滑肌本生的舒張能力下降所致,因為硝普鈉(sodium nitroprusside, SNP)介導(dǎo)的血管舒張功能在肥胖Zucker大鼠中并沒有受損。
　　4、與瘦Zucker大鼠比較,胖Zucker大鼠腸系膜三級動脈中D1受體的表達下降而其磷酸化增加。
　　第二部分:高胰島素血癥和高糖血癥在肥胖Zucker大鼠腸系膜三級動脈D1受體介導(dǎo)的血管舒張功能受損中的作用
　　1

13、、羅格列酮灌胃6周后,胖Zucker大鼠血漿胰島素、血糖水平下降,血壓有所降低。同時羅格列酮可以部分恢復(fù)fennoldopam對胖Zucker大鼠腸系膜三級血管的舒張功能,并且胖Zucker大鼠腸系膜動脈組織中D1受體的表達增加而其磷酸化水平有所下降。
　　2、喂食一個月高脂食物后,瘦Zucker大鼠血漿胰島素水平有所增加而血漿葡萄糖水平和血壓均無明顯改變。一次性鏈霉素(streptomycin,STZ)腹腔注射一個月后瘦Zuck

14、er大鼠血糖明顯增加,血壓有所增加而血漿胰島素水平無明顯變化。高胰島素和高糖模型的瘦Zucker大鼠腸系膜三級動脈均顯示出對fenoldopam的反應(yīng)性下降以及D1受體表達下降、磷酸化增加但前者的表現(xiàn)出更為明顯的D1受體功能受損。
　　第三部分:體外實驗予以高胰島素和高糖刺激大鼠胚胎胸主動脈平滑肌細胞,觀察其D1受體表達和磷酸化的變化
　　1、加入高胰島素和高糖刺激24小時后,大鼠胚胎胸主動脈平滑肌細胞(A10 cells)

15、中D1受體的表達量下降而磷酸化水平增加。
　　2、預(yù)先加入絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)抑制劑PD98059可以部分阻斷高胰島素對D1受體的作用。
　　結(jié)論:
　　通過本實驗發(fā)現(xiàn),肥胖 Zucker大鼠中的高胰島素血癥和高糖血癥均可以減少 D1受體的表達和增加其磷酸化從而損傷D1受體介導(dǎo)的血管舒張功能。在這個過程中,肥胖Zucker大鼠中的高胰島素血癥對