敲減視網(wǎng)膜多巴胺D1受體對(duì)小鼠正常屈光發(fā)育的影響.pdf

1、目的：近視是一種全世界發(fā)病率最高的屈光不正，相對(duì)于正常眼球，近視眼球的鞏膜后極部主動(dòng)過(guò)度延伸，導(dǎo)致來(lái)自遠(yuǎn)處的平行光線，無(wú)法在視網(wǎng)膜上清晰成像。此過(guò)程中，視網(wǎng)膜上的信號(hào)輸入?yún)⑴c了鞏膜生長(zhǎng)和眼球屈光發(fā)育的調(diào)控，而形覺(jué)剝奪性近視形成過(guò)程中，眼球中的多巴胺含量與近視呈現(xiàn)高度相關(guān)性。本課題組前期實(shí)驗(yàn)研究及其他實(shí)驗(yàn)室均有發(fā)現(xiàn)多巴胺D1受體(DRD1)激動(dòng)劑可以抑制形覺(jué)剝奪性近視的進(jìn)展，但藥物具體作用部位及結(jié)果仍不明確。本實(shí)驗(yàn)將利用腺相關(guān)病毒(ade

2、no-associated virus，AAV)及短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)結(jié)構(gòu)沉默視網(wǎng)膜的多巴胺D1受體的信使RNA(mRNA)，以研究敲減視網(wǎng)膜多巴胺D1受體對(duì)小鼠屈光發(fā)育的作用。
　　方法：(1)在所有不同的血清型的AAV中篩選出符合實(shí)驗(yàn)要求的血清型AAV:分別采用視網(wǎng)膜下注射（1μL，1×1012顆粒/ml）和玻璃體腔注射(1-10μL，1×1012顆粒/ml)兩種注射方式，將所有不同血

3、清型的AAV注射到3周齡小鼠的視網(wǎng)膜下腔或玻璃體腔。在注射后1周、2周、4周觀察小鼠視網(wǎng)膜病毒感染情況。選出能在較短時(shí)間感染大范圍視網(wǎng)膜的病毒血清型。(2)在改造后過(guò)表達(dá)多巴胺D1受體的293T細(xì)胞系上篩選出敲減多巴胺D1受體效率最高的，針對(duì)DRD1的小干擾RNA序列(siDRD1)，再合成相同序列的shDRD1并與篩選出的AAV合成，以能夠?qū)⒏咝侍禺愋郧脺p多巴胺D1受體的shDRD1導(dǎo)入視網(wǎng)膜中。(3)視網(wǎng)膜多巴胺D1受體敲減小鼠屈

4、光發(fā)育的變化:采用出生后21天野生型(wildtype，WT)雄性近交C57BL/6小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，將動(dòng)物分成正常組，通過(guò)腺相關(guān)病毒導(dǎo)入隨機(jī)序列的對(duì)照組和導(dǎo)入shDRD1的實(shí)驗(yàn)組。在小鼠出生后3周采用玻璃體腔注射或視網(wǎng)膜下注射將載有shDRD1的AAV(AAV-shDRD1)注入到小鼠玻璃體腔（1μL），分別在小鼠4周齡、6周齡、7周齡、8周齡時(shí)檢測(cè)視網(wǎng)膜病毒感染狀況、小鼠眼球屈光度及眼軸長(zhǎng)度、小鼠眼球視網(wǎng)膜電生理(ERG)、小鼠視網(wǎng)膜

5、多巴胺D1受體敲減效率等參數(shù)。
　　結(jié)果：(1)AAV8可以在較短時(shí)間內(nèi)感染視網(wǎng)膜，并且其對(duì)視網(wǎng)膜的感染面積大于同時(shí)間下其他不同血清型AAV.(2)篩選出的敲減效率較高的兩條siRNA序列分別為ugaucagcguggacagguauutt和aaugcucucaaucagaaaguutt。(3)采用玻璃體腔注射方法，對(duì)照組相對(duì)于正常組，小鼠視網(wǎng)膜多巴胺D1受體敲減效率按α=0.05水準(zhǔn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，小鼠也沒(méi)有明顯的眼球眼球發(fā)

6、育及眼球參數(shù)上的異常。實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組，小鼠視網(wǎng)膜多巴胺D1受體敲減效率按α=0.05水準(zhǔn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，小鼠3周到6周時(shí)，眼球屈光度變化按α=0.05水準(zhǔn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，小鼠7周時(shí)視網(wǎng)膜電生理(ERG)按α=0.05水準(zhǔn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用視網(wǎng)膜下注射方法，對(duì)照組相對(duì)于正常組，小鼠視網(wǎng)膜多巴胺D1受體敲減效率按α=0.05水準(zhǔn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，3周到6周時(shí)，小鼠眼球出現(xiàn)近視，玻璃體腔延長(zhǎng)，眼軸長(zhǎng)度增加，電生理反應(yīng)下降(

7、p＜0.05)。實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組，小鼠視網(wǎng)膜多巴胺D1受體表達(dá)降低，敲減效率約為60％(p＜0.05)。小鼠3周到6周時(shí)，眼球屈光變化按α=0.05水準(zhǔn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，小鼠3周到6周時(shí)眼軸長(zhǎng)度及玻璃體腔深度變化，按α=0.05水準(zhǔn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，小鼠7周時(shí)視網(wǎng)膜電生理(ERG)按α=0.05水準(zhǔn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：(1)AAV8以其對(duì)視網(wǎng)膜感染速度較快，感染范圍較大而適合向視網(wǎng)膜導(dǎo)入目的基因。(2)序列uga

8、ucagcguggacagguauutt和ugagcaggacauacgccauutt的兩條siDRD1片段在過(guò)表達(dá)多巴胺D1受體的細(xì)胞系上共同作用有較好的敲減效率。(3)采用玻璃體腔注射的方法注射AAV-shDRD1，在現(xiàn)有條件下并不能較好的敲減視網(wǎng)膜多巴胺D1受體。采用視網(wǎng)膜下注射的方法注射AAV-shDRD1，可以特異性的敲減視網(wǎng)膜多巴胺D1受體，且鞏膜不受影響，可以作為一種特異性敲減視網(wǎng)膜多巴胺D1受體的動(dòng)物模型，但注射方法及病