鞏膜特異性A2A受體基因抑制小鼠的屈光發(fā)育研究.pdf

1、目的：
　　 鞏膜是近視的最終效應(yīng)器。A2A受體基因敲除小鼠在生后發(fā)育過程中出現(xiàn)明顯的相對(duì)近視，同時(shí)伴有眼軸的延長(zhǎng)和后極部鞏膜膠原纖維直徑變細(xì)。本研究建立了鞏膜特異性A2A受體基因抑制小鼠模型，從而確定小鼠鞏膜成纖維細(xì)胞中腺苷A2A受體在小鼠屈光發(fā)育中的作用。通過以上的研究，將有助我們深入理解腺苷A2A受體在近視發(fā)生發(fā)展過程中的作用與調(diào)控機(jī)制，提高針對(duì)A2A受體療法改善近視發(fā)展的可能性，為近視的藥物治療奠定基礎(chǔ)。
　　

2、方法：
　　 采用基于Cre/loxP技術(shù)的選擇性基因敲除方法建立鞏膜特異性A2A受體基因抑制小鼠。應(yīng)用條件型A2A受體基因敲除小鼠（A2Af/f，即在A2A受體基因exon2兩端插入兩個(gè)loxP序列），將改建的腺相關(guān)病毒AAV-Cre載體于Tenon's囊下注射到小鼠鞏膜組織周圍，利用局部AAV-Cre表達(dá)的Cre酶將兩個(gè)loxP序列之間的A2A受體基因exon2剔除掉，從而實(shí)現(xiàn)鞏膜特異性A2A受體基因抑制。我們通過小鼠Ten

3、on's囊下注射AAV，篩選出可以高效感染小鼠鞏膜的血清型，據(jù)此構(gòu)建AAV-Cre載體。為了驗(yàn)證AAV-Cre的作用，另由于紋狀體高表達(dá)A2A受體基因，本實(shí)驗(yàn)通過將AAV-Cre載體注射到A2Af/f小鼠紋狀體，檢測(cè)AAV-Cre能否特異性抑制A2A受體基因。
　　 采用出生后21日齡A2Af/f小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，隨機(jī)分成AAV-Cre組、AAV對(duì)照組兩組。AAV-Cre組和AAV對(duì)照組小鼠均取一只眼睛進(jìn)行Tenon's囊下注射

4、腺相關(guān)病毒，對(duì)側(cè)眼不作任何處理。分別在注射前、注射后2周、4周和6周應(yīng)用紅外偏心驗(yàn)光儀(EIR)檢測(cè)A2Af/f小鼠屈光度，光學(xué)相干斷層掃描儀(OCT)檢測(cè)A2Af/f小鼠眼球生物學(xué)參數(shù)，包括角膜厚度、前房深度、晶狀體厚度、玻璃體腔深度、視網(wǎng)膜厚度及眼軸長(zhǎng)度等，角膜曲率計(jì)檢測(cè)角膜曲率以及體重的測(cè)量等。在AAV-Cre注射后6周取材，應(yīng)用RT-qPCR檢測(cè)A2Af/f小鼠鞏膜A2A受體和膠原Ⅰ，Ⅲ，Ⅴ在mRNA水平的變化。
　　

5、結(jié)果：
　　 1 AAV1-EGFP感染小鼠鞏膜結(jié)果顯示Tenon's囊下注射AAV1-EGFP后，EGFP僅在小鼠鞏膜表達(dá)，而在視網(wǎng)膜不表達(dá)，表明腺相關(guān)病毒血清型1可以高效感染小鼠鞏膜;
　　 2 AAV1-EGFP感染A2Af/f小鼠紋狀體后有豐富的EGFP表達(dá)，AAV1-Cre感染A2Af/f小鼠紋狀體后，可以使紋狀體A2A受體mRNA的表達(dá)下降約43％;
　　 3AAV1-Cre感染A2Af/f小鼠鞏膜6

6、周后，可以使鞏膜A2A受體mRNA的表達(dá)下降約57.5％;
　　 4 A2Af/f小鼠Tenon's囊下注射AAV1-Cre2周、4周和6周后，AAV1-Cre注射眼與對(duì)側(cè)眼及AAV1注射眼相比，屈光度、角膜前表面中央曲率、玻璃體腔深度和眼軸長(zhǎng)度等生物學(xué)參數(shù)均無(wú)明顯差異;
　　 5 AAV1-Cre感染A2Af/f小鼠鞏膜6周后，鞏膜膠原Ⅰ，Ⅲ，ⅤmRNA的表達(dá)無(wú)明顯變化。
　　 結(jié)論：
　　 A2Af/

7、f小鼠Tenon's囊下注射AAV1-Cre可以特異性抑制小鼠鞏膜成纖維細(xì)胞上的腺苷A2A受體基因，使其mRNA表達(dá)下降近57.5％，這表明我們成功構(gòu)建了鞏膜特異性A2A受體基因抑制小鼠。然而與對(duì)側(cè)眼及AAV1注射眼相比，屈光度及玻璃體腔深度、眼軸長(zhǎng)度等生物學(xué)參數(shù)均無(wú)明顯差異，可能是由于AAV1-Cre感染鞏膜特異性抑制A2A受體的效率較低，不足以使A2Af/f小鼠出現(xiàn)近視的特征性的變化;或是由于5周齡后小鼠近視已經(jīng)開始恢復(fù)，故并不能夠