VIP及受體VIPR2在小鼠正常屈光發(fā)育及形覺剝奪近視中的作用研究.pdf

1、本文對VIP及受體VIPR2在小鼠正常屈光發(fā)育及形覺剝奪近視中的作用進行了研究。本研究分為三個部分：
　　第一部分 VIP和VIPR2與近視的相關性驗證研究。
　　目的：通過對形覺剝奪性近視小鼠視網膜進行轉錄組測序，發(fā)現(xiàn)一個差異基因-血管活性腸肽（VIP）可能與近視有關，另外通過Meta關聯(lián)分析在中國人群中發(fā)現(xiàn)VIP的受體-VIPR2可能為高度近視的易感基因。本研究部分將進一步明確VIP及受體VIPR2在眼球中的表達分布以及

2、在近視進展中發(fā)揮作用的時間點和可能的作用部位。并進一步通過病例-對照關聯(lián)分析驗證 VIP受體（VIPR1、VIPR2）是否為病理性近視的易感基因。
　　方法：將21日齡C57BL/6J小鼠隨機分組后進行短期（1d、2d）和中長期（1W、2W和4W）剝奪處理。3周齡 C57BL/6J小鼠正常小鼠眼球取材，逆轉錄 PCR（RT-PCR）檢測VIP和VIPR2在小鼠眼各組織表達；小鼠形覺剝奪處理完成后取視網膜和鞏膜，實時熒光定量PCR（

3、quantitative Real-Time PCR, qRT-PCR）檢測視網膜和鞏膜中VIP和VIPR2 mRNA表達水平變化；通過病例-對照關聯(lián)分析，檢測VIPR1、VIPR2的SNPs是否與病理性近視相關。
　　結果：RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)VIP在小鼠視網膜中高表達，在脈絡膜及RPE、角膜和鞏膜也有表達，而在虹膜和晶狀體未見表達；VIPR2在所取的眼球各組織均廣泛表達。短期形覺剝奪（1d、2d），剝奪眼相比對側眼和正常對照眼

4、，視網膜中VIP mRNA表達水平顯著下調（FD-1d,P＜0.05; FD-2d,P＜0.001）；而剝奪眼視網膜VIPR2 mRNA水平表達相比對側眼和正常對照眼均明顯增加（P＜0.05）。在中長期形覺剝奪（1W、2W、4W）時，剝奪眼相比對側眼和正常對照眼視網膜中VIP、VIPR2表達水平均無統(tǒng)計學差異。無論短期還是中長期剝奪，鞏膜中VIP、VIPR2在各眼中的表達變化均無統(tǒng)計學差異。對VIPR1、VIPR2進行關聯(lián)分析和獨立重復

5、樣本驗證， Meta分析發(fā)現(xiàn) VIPR2基因 SNP（ rs6979985）具顯著性差異（P=5.64×10-8），未發(fā)現(xiàn)VIPR1上的SNP有統(tǒng)計學差異。
　　結論：VIP和VIPR2在小鼠眼組織均有表達，VIPR2表達更為廣泛。VIP和VIPR2在形覺剝奪早期明顯變化，表明VIP和VIPR2可能參與而且是在早期參與近視的調控，由于鞏膜中的VIP和VIPR2均未發(fā)現(xiàn)變化，推測可能是視網膜而不是鞏膜中的VIP參與并通過VIPR2參

6、與近視調控進程。通過關聯(lián)分析明確VIPR2基因 SNP(rs6979985)與病理性近視相關，表明 VIPR2可能為病理性近視的一個易感基因，而VIPR1可能不是病理性近視的一個易感基因。
　　第二部分：動物藥理學實驗明確VIPR2是否影響近視形成。
　　目的：第一部分初步明確VIP和VIPR2與近視有關，但兩者之間因果關系并未明確。本部分研究將通過藥理學實驗（VIPR2拮抗劑和激動劑）明確VIPR2功能異常是否影響正常屈光

7、發(fā)育和形覺剝奪性近視的進展，初步闡明VIPR2在正常屈光發(fā)育和FDM中的作用。
　　方法：將21日齡的C57BL/6J小鼠隨機實驗組和溶劑對照組。正常屈光發(fā)育實驗分成VIPR2拮抗劑組（PG99-465, n=21）和溶劑組（DMSO, n=18），PG99-465按3 mg/kg·d劑量腹腔注射給藥4周；形覺剝奪實驗分成形覺剝奪+VIPR2激動劑組（Ro25-1553, n=17）和形覺剝奪+溶劑組（DMSO, n=22），Ro

8、25-1553按0.3 mg/kg·d劑量腹腔注射給藥4周。實驗結束后檢測屈光和眼軸等生物學參數(shù)。結果：VIPR2拮抗劑（PG99-465）注射2周和4周后，PG99-465給藥組相對溶劑組（DMSO）明顯向近視漂移，2周平均漂移約-3.75 D（P＜0.01），4周約-4.77 D（P＜0.01）。玻璃體腔深度相對變長，但只在給藥4周時左眼具統(tǒng)計學差異（P＜0.05）；前房深度相對變短，在給藥2周時左眼，給藥4周時左右眼具有統(tǒng)計學差異

9、（P＜0.001）；而眼軸卻相對略有變短趨勢，給藥2周左眼具統(tǒng)計學差異（P＜0.05），其它生物學參數(shù)無顯著性差異。形覺剝奪+VIPR2激動劑（Ro25-1553）給藥4周后發(fā)現(xiàn)Ro25-1553與溶劑組比較可明顯抑制FDM進展（-1.77 D，P＜0.05），形覺剝奪后剝奪眼相比對側眼，玻璃體腔和眼軸等發(fā)生相應的延長（玻璃體腔P＜0.001；眼軸P＜0.05）。
　　結論：注射VIPR2拮抗劑PG99-465）可誘導出相對性近視

10、，而給予VIPR2激動劑（Ro25-1553）可抑制形覺剝奪性近視（FDM）的形成，表明VIPR2參與并影響正常屈光發(fā)育和FDM的形成。
　　第三部分：VIPR2基因全身敲除小鼠對屈光發(fā)育的影響。
　　目的：由于藥理學實驗藥物存在特異性不足，進一步利用VIPR2基因敲除小鼠，明確VIPR2是否為近視形成的原因，并初步探討其分子致病機制。
　　方法：利用CRISPR-Cas9技術，構建VIPR2全身基因敲除小鼠，在4周、

11、5周、6周、8周、10周及12周齡時間點分別檢測屈光及眼軸等生物學參數(shù)，檢測VIPR2是否影響屈光發(fā)育。在不同的時間點分別進行視網膜電生理、眼底、血管造影、眼前節(jié)檢查及眼組織形態(tài)學觀察，明確VIPR2對視網膜及視覺功能的影響。
　　結果：VIPR2全身敲除小鼠相比野生型同窩仔，屈光明顯向近視方向漂移，整體平均漂移約-3.24 D，并具有統(tǒng)計學差異（兩因素重復測量方差分析，bonferroni校正，P＜0.05），并且在不同的時間點

12、（4W、5 W、8 W、10 W）均具統(tǒng)計學差異（多變量方差分析，P＜0.05）。7W電生理檢測發(fā)現(xiàn)在暗適應條件下，VIPR2-KO小鼠的a波和b波振幅相對野生型明顯升高；而振蕩電位（OPs）振幅在-25 dB刺激強度時，VIPR2-KO小鼠OP1明顯升高（P＜0.05）；在-10 dB時，VIPR2-KO小鼠OP1、OP2明顯升高（P＜0.05）。眼底照相及熒光血管造影、眼前節(jié)和組織形態(tài)學檢查并無明顯變化。
　　結論：VIPR2