衰老引起腸系膜上動脈內(nèi)皮功能損傷的機(jī)制.pdf

1、目的:
　　血液流動產(chǎn)生的剪切力作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而調(diào)節(jié)血管張力和直徑。內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)剪切力誘導(dǎo)產(chǎn)生一些血管舒張因子使血管平滑肌擴(kuò)張是影響血管直徑擴(kuò)張的主要因素。瞬時感受器電位通道（TRP）家族香草素受體亞家族（TRP vanilloid subtype4，TRPV4）參與了這一過程，它是鈣通透的非選擇陽離子通道,介導(dǎo)了內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)鈣離子增加。本研究中，利用血管直徑檢測系統(tǒng)比較年輕大鼠與老年大鼠腸系膜上動脈剪切力以及TPPV4通道激

2、動劑4α-PDD誘導(dǎo)的血管舒張程度。利用鈣成像技術(shù)檢測原代培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞（mesenteric artery endothelial cells，MAECs)剪切力以及4α-PDD誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化。采用蛋白免疫印跡以及免疫熒光染色法比較老年大鼠與年輕大鼠腸系膜上動脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的 TRPV4蛋白含量表達(dá)水平。
　　方法:
　　1.動物分組雄性清潔級成年Sprague-Dawley大鼠，分為兩組：年輕大鼠3～4月齡，老

3、年大鼠20～22月齡。
　　2.原代培養(yǎng)腸系膜上動脈內(nèi)皮細(xì)胞將分離出的腸系膜上動脈置于10mL含0.02％的膠原蛋白酶PBS（phosphate-buffered saline)液中，置于37oC恒溫水浴振蕩器中蕩分離出內(nèi)皮細(xì)胞，種于培養(yǎng)皿，放入CO2溫箱中培養(yǎng)3-5天，用于后續(xù)實驗。
　　3.鈣離子成像用鈣離子熒光指示劑Fluo-8和普流羅尼類F-127孵育細(xì)胞30 min。熒光比率（F1/F0）表示細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化

4、。萊卡TCS SP5共聚焦系統(tǒng)記錄并分析熒光信號。以毒胡蘿卜素誘導(dǎo)鈣庫釋放后，加入TRPV4通道蛋白抑制劑RN1734，再加入鈣離子，觀察細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化；改變浴槽兩側(cè)壓力，觀察老年組和年輕組腸系膜上動脈內(nèi)皮細(xì)胞剪切力誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化情況。
　　4.檢測腸系膜上動脈血管直徑變化將分離好的腸系膜上動脈血管段固定于血管直徑檢測系統(tǒng)（Danish MyoTechnology，Denmark，model110P）中，觀察老年大

5、鼠和年輕大鼠腸系膜上動脈剪切力誘導(dǎo)內(nèi)皮依賴性血管舒張的變化；使用TRPV4通道抑制劑RN1734，阻斷TRPV4通道，觀察腸系膜上動脈剪切力誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性血管舒張的變化；使用TRPV4通道激動劑4α-PDD，觀察老年大鼠和年輕大鼠腸系膜上動脈剪切力誘導(dǎo)內(nèi)皮依賴性血管舒張的變化。
　　5.蛋白免疫印跡和免疫熒光染色：使用anti-TRPV4抗體，分別檢測老年大鼠和年輕大鼠腸系膜上動脈內(nèi)皮細(xì)胞 TRPV4蛋白表達(dá)的水平。
　　

6、6.統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（?x±SE）表示，組間樣本比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。以P<0.05視為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.剪切力誘導(dǎo)引起大鼠腸系膜上動脈剪切力引起的血管舒張反應(yīng)與內(nèi)皮細(xì)胞鈣濃度的變化。與年輕組相比,老年組腸系膜上動脈剪切力誘導(dǎo)的血管舒張反應(yīng)和原代培養(yǎng)的腸系膜上動脈內(nèi)皮細(xì)胞剪切力誘導(dǎo)Ca2+濃度升高的效應(yīng)明顯減弱；<

7、br>　　2.4α-PDD誘導(dǎo)的血管舒張以及其引起的內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化與年輕大鼠相比，老年大鼠TRPV4通道蛋白激動劑4α-PDD誘導(dǎo)的血管舒張反應(yīng)明顯減弱；與年輕組相比，加入TRPV4通道蛋白激動劑4α-PDD誘導(dǎo)的腸系膜上動脈內(nèi)皮細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+濃度升高明顯減弱；
　　3.驗證TRPV4在剪切力誘導(dǎo)的腸系膜動脈內(nèi)皮細(xì)胞鈣濃度增加和血管舒張的作用。TRPV4通道蛋白抑制劑RN1734顯著抑制剪切力誘導(dǎo)的腸系膜上動脈內(nèi)皮細(xì)胞