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文檔簡(jiǎn)介
1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述:
第一部分 趨化因子CCR5促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞向動(dòng)脈內(nèi)皮損傷部位遷移的研究
目的:
探討趨化因子CCR5在內(nèi)皮祖細(xì)胞向內(nèi)皮損傷部位遷移的趨化作用。
方法:
1.動(dòng)物模型
10-12周齡的2型糖尿病ApoE-/-C57BL/6J雄性脾切除小鼠用于實(shí)驗(yàn)。選取8-10周齡野生型C57BL/6J雄性小鼠用于內(nèi)皮祖細(xì)胞提取。
2.脾切除手術(shù)
2、 8-10周齡的ApoE-/-C57BL/6J雄性小鼠給予0.8%戊巴比妥鈉(10 mg/kg)麻醉,沿小鼠左側(cè)腹部行10-15mm切口,脾臟周圍的動(dòng)靜脈被結(jié)扎后移除脾臟,小鼠術(shù)后適應(yīng)性喂養(yǎng)7-14天,再行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
3.小鼠2型糖尿病模型的建立
將脾切除的ApoE-/-C57BL/6J小鼠,按小鼠每公斤體重給予35mg鏈脲佐菌素(STZ,35mg/kg),腹腔注射STZ溶液,間隔24h后再次腹腔注射給藥,連續(xù)注射3
3、天。對(duì)照組,ApoE-/-C57BL/6J小鼠腹腔給予等量的檸檬酸鈉緩沖液。造模后每天檢測(cè)小鼠體重變化,每周測(cè)量小鼠血糖,當(dāng)血糖值在300 mg/dl及其以上者,作為2型糖尿病模型成功標(biāo)準(zhǔn)。
4.小鼠骨髓來源內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定
選取8-10周齡野生型C57BL/6J雄性小鼠頸椎脫臼處死,無菌條件下,分離提取小鼠脛骨,股骨和髂骨中的單個(gè)核細(xì)胞,梯度離心后接種在纖維連結(jié)蛋白包被的六孔板中,放置于37℃,5% C
4、O2孵箱中培養(yǎng),三天后細(xì)胞第一次給予完全換液,棄掉未貼壁的細(xì)胞。第六天時(shí),細(xì)胞給予半量換液,繼續(xù)培養(yǎng)至第七天即用于鑒定。細(xì)胞分別給予DiI-acLDL,BS-1 lectin和DAPI染色后,熒光顯微鏡觀察陽性染色細(xì)胞,三色熒光陽性染色的細(xì)胞即為內(nèi)皮祖細(xì)胞。
5.慢病毒轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞
將過表達(dá)CCR5質(zhì)粒的慢病毒載體按MOI=40轉(zhuǎn)染入內(nèi)皮祖細(xì)胞中,攜帶有空白質(zhì)粒的慢病毒載體轉(zhuǎn)染入內(nèi)皮祖細(xì)胞中作為陰性對(duì)照,轉(zhuǎn)染24小
5、時(shí)后給予完全換液,熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況,繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)。在內(nèi)皮祖細(xì)胞移植之前,培養(yǎng)的細(xì)胞給予CM-DiI(4 mg/ml)活細(xì)胞染料孵育15分鐘,雙重標(biāo)記的EPCs被收集,用于下一步試驗(yàn)。
6.試驗(yàn)設(shè)計(jì)
40只脾切除的2型糖尿病ApoE-/-C57BL/6J雄性小鼠給予高膽固醇飲食喂養(yǎng)24周,然后根據(jù)小鼠耳標(biāo)號(hào),應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表,將老鼠隨機(jī)分為三組:Control組:尾靜脈給予200μl無菌的P
6、BS,Lenti-EGFP組:尾靜脈給予200μl1×106攜帶有空載質(zhì)粒的內(nèi)皮祖細(xì)胞,Lenti-CCR5組:尾靜脈給予200μl1×106攜帶有過表達(dá)CCR5質(zhì)粒的內(nèi)皮祖細(xì)胞。
7.免疫熒光檢測(cè)
CD31免疫熒光染色檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈根處內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)分布。
8.內(nèi)皮祖細(xì)胞功能學(xué)檢測(cè)
Transwell遷移小室和Edu增殖能力實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移和增殖能力。
9.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
7、 所有統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)均使用SPSS18.0軟件分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,計(jì)數(shù)資料以數(shù)值和百分比表示。統(tǒng)計(jì)分析采用t檢驗(yàn)、Oneway AN0VA或LSD post-hoc分析。當(dāng)P<0.05被認(rèn)為具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
結(jié)果:
1.成功構(gòu)建重組過表達(dá)慢病毒載體
經(jīng)重組慢病毒載體測(cè)序?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證,CCR5慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建和包裝成功,空白載體的慢病毒滴度為3×1010 ifu/ml,CCR5過表達(dá)載體的慢病
8、毒滴度為2.8×1010 ifu/ml。
2.成功分離提取和鑒定EPCs
EPCs培養(yǎng)至第7天,細(xì)胞分別給予DiI-acLDL(紅色),BS-1 lectin(綠色)和DAPI(藍(lán)色)染色后,結(jié)果發(fā)現(xiàn)90%以上細(xì)胞均能成功攝取DiI-acLDL和BS-1 lectin,表現(xiàn)為三色熒光(紅色+綠色+藍(lán)色)陽性。
3.慢病毒轉(zhuǎn)染EPCs后感染效率
免疫熒光評(píng)價(jià)EPCs轉(zhuǎn)染慢病毒后的感染效率,結(jié)果發(fā)現(xiàn)8
9、0%及以上的細(xì)胞為綠色熒光蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞,提示慢病毒轉(zhuǎn)染成功。
4.過表達(dá)CCR5增加EPCs向內(nèi)皮損傷部位的歸巢,動(dòng)員
5.過表達(dá)CCR5增加EPCs遷移能力
為了檢測(cè)CCR5對(duì)EPCs功能學(xué)影響,我們分別檢測(cè)了Lenti-EGFP和Lenti-CCR5兩組細(xì)胞的增殖和遷移能力的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在趨化因子CCL5存在的情況下,Lenti-CCR5組能明顯增加EPCs遷移能力(P<0.01),但是兩組細(xì)胞
10、的增殖能力并未見明顯差異(P=0.98)。
結(jié)論:
1.過表達(dá)CCR5能夠增加內(nèi)皮祖細(xì)胞向動(dòng)脈內(nèi)皮損傷部位的歸巢、動(dòng)員作用;
2.過表達(dá)CCR5能提高內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移能力,但是對(duì)其增殖能力沒有影響。
第二部分 過表達(dá)內(nèi)皮祖細(xì)胞上CCR5改善動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性
目的:
探討過表達(dá)內(nèi)皮祖細(xì)胞上CCR5對(duì)動(dòng)脈粥樣斑塊穩(wěn)定性研究。
方法:
1.動(dòng)物模型
11、10-12周齡的ApoE-/-C57BL/6J雄性脾切除小鼠用于實(shí)驗(yàn)。選取8-10周齡的野生型C57BL/6J雄性小鼠用于內(nèi)皮祖細(xì)胞的提取。
2.脾切除手術(shù)
8-10周齡的ApoE-/-C57BL/6J雄性小鼠給予0.8%戊巴比妥鈉(10 mg/kg)麻醉,沿小鼠左側(cè)腹部行10-15mm切口,脾臟周圍的動(dòng)靜脈被結(jié)扎后移除脾臟,小鼠術(shù)后適應(yīng)性喂養(yǎng)7-14天,再行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
3.小鼠骨髓來源的EPCs分離、培養(yǎng)
12、及鑒定
選取8-10周齡的野生型C57BL/6J雄性小鼠頸椎脫臼處死,無菌條件下,分離提取小鼠脛骨,股骨和髂骨中的單個(gè)核細(xì)胞,梯度離心后接種在纖維連結(jié)蛋白包被的六孔板中,放置于37℃,5%CO2孵箱中培養(yǎng),三天后細(xì)胞第一次給予完全換液,棄掉未貼壁的細(xì)胞。第六天時(shí),細(xì)胞給予半量換液,繼續(xù)培養(yǎng)至第七天即用于鑒定。
4.慢病毒轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞
將過表達(dá)CCR5質(zhì)粒的慢病毒載體按MOI=40轉(zhuǎn)染入內(nèi)皮祖細(xì)胞中,攜帶有
13、空白質(zhì)粒的慢病毒載體轉(zhuǎn)染入內(nèi)皮祖細(xì)胞中作為陰性對(duì)照,轉(zhuǎn)染24小時(shí)后給予完全換液,熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況,繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)。
5.試驗(yàn)設(shè)計(jì)
60只脾切除的ApoE-/-C57BL/6J雄性小鼠給予高膽固醇飲食喂養(yǎng)24周,然后應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表,將老鼠隨機(jī)分為三組:Control組:尾靜脈給予200μl無菌的PBS,Lenti-EGFP組:尾靜脈給予200μl1×106攜帶有空載質(zhì)粒的內(nèi)皮祖細(xì)胞,Lent
14、i-CCR5組:尾靜脈給予200μl1×106攜帶有過表達(dá)CCR5質(zhì)粒的內(nèi)皮祖細(xì)胞。內(nèi)皮祖細(xì)胞輸注后,所有老鼠改為普通飲食,繼續(xù)喂養(yǎng)6周后處死。
6.組織病理、免疫組化及免疫熒光檢測(cè)
油紅O染色實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)小鼠主動(dòng)脈根處動(dòng)脈粥樣斑塊面積,免疫組織化學(xué)染色方法分別檢測(cè)人和小鼠冠狀動(dòng)脈處CCL5和CCR5的表達(dá)、小鼠主動(dòng)脈根處平滑肌α肌動(dòng)蛋白、單核/巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞,、炎癥因子IL-6、MMP9等表達(dá)。免疫熒光染色方法檢測(cè)
15、小鼠主動(dòng)脈根處內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)。
7.免疫化學(xué)檢測(cè)
小鼠給予內(nèi)皮祖細(xì)胞移植后分別于0周和6周采集全血,高速離心后,收集血清。應(yīng)用小鼠動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的蛋白芯片檢測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的22個(gè)炎癥指標(biāo)變化,Cluster version3.0和Java Tree View version1.60軟件用于分析蛋白芯片的結(jié)果。
8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
所有統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)均使用SPSS18.0軟件分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差
16、表示,計(jì)數(shù)資料以數(shù)值和百分比表示。統(tǒng)計(jì)分析采用t檢驗(yàn)、Oneway AN0VA或LSD post-hoc分析。當(dāng)P<0.05被認(rèn)為差異具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)果:
1.CCL5和CCR5在人和ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣斑塊中的表達(dá)和分布情況
2.過表達(dá)CCR5增加EPCs向內(nèi)皮損傷部位的歸巢,動(dòng)員
3.過表達(dá)內(nèi)皮祖細(xì)胞上CCR5對(duì)動(dòng)脈粥樣斑塊穩(wěn)定性影響
4.過表達(dá)內(nèi)皮祖細(xì)胞上CCR5降
17、低高脂血癥水平
5.過表達(dá)內(nèi)皮祖細(xì)胞上CCR5對(duì)內(nèi)皮功能的影響
6.過表達(dá)內(nèi)皮祖細(xì)胞上CCR5降低炎癥因子表達(dá)
7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
所有統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)均使用SPSS18.0軟件分析。計(jì)量資料以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示,計(jì)數(shù)資料以數(shù)值和百分比表示。統(tǒng)計(jì)分析采用t檢驗(yàn)、Oneway AN0VA或LSD post-hoc分析。當(dāng)P<0.05被認(rèn)為差異具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)論:
1.趨化因子CCL
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