Klotho抑制EPCs衰老促進老齡小鼠損傷動脈再內皮化的研究.pdf

1、1.背景與目的:
　　 自從1904年德國萊比錫病理學家March,and首次提出動脈粥樣硬化(A,therosclerosis,AS)一詞以來,歷經一個多世紀,人們對AS的認識已逐步深入。然而,目前動脈粥樣硬化發(fā)病率和致死率仍然很高,AS導致的心腦血管疾病仍是當今人類死亡的首位原因之一。AS是一種退行性和增生性病變,與衰老有著密切的關系。而我國擁有世界上最龐大的老年人群,AS的遷延性和難愈性不僅嚴重危害了老年患者的健康,還導致

2、醫(yī)學資源連續(xù)消耗。研究衰老在AS發(fā)生發(fā)展中的機制對于預防和治療AS有著重要的意義,有較大的學術價值和社會效應。
　　 AS的發(fā)病機制十分復雜,目前認為,血管內皮結構和功能損傷可能是動脈粥樣硬化的病理生理基礎,內皮損傷己被證明是AS最早期的改變,而損傷血管有效地再內皮化可以維持血管內皮細胞單層的完整性,預防AS的發(fā)生。目前促進損傷血管修復的措施主要有以下幾種:戒煙等生活方式的改善;應用藥物如他汀類藥物、血管緊張素轉換酶抑制劑、沙坦

3、類藥物、胰島素增敏劑等抗氧化藥物保護血管內皮細胞功能;血管內皮生長因子抑制內皮細胞凋亡;血管內皮祖細胞(Endothelial Progenitor Cells,EPCs)移植。
　　 以EPCs為基礎的細胞療法修復損傷血管已成為大家關注的方向。EPCs由造血干細胞分化而來,是血管內皮細胞的前體細胞,表達干細胞及內皮細胞相關抗原,主要來源于骨髓、胎肝、臍血和脾臟。傳統(tǒng)觀點認為血管損傷后修復主要依賴于鄰近成熟內皮細胞的遷移和生長增

4、殖。而新近的研究表明骨髓和外周血中EPCs是血管內皮損傷修復的最重要的機制之一。在血管內皮損傷后,EPCs從骨髓中動員并歸巢于損傷血管內皮局部,分化為成熟內皮細胞,加快損傷血管再內皮化,抑制病理性新生內膜的形成,在血管內皮損傷修復中起著重要的作用。
　　 EPC的數(shù)量和活性受到多種生理和病理因素的影響,包括年齡、高血壓、高糖、氧化LDL、慢性腎功能衰竭等等。研究表明單純的年齡增加會使大鼠EPC動員減少,增殖、黏附和遷移能力降低,

5、并且發(fā)現(xiàn)EPCs參與損傷血管再內皮化的過程具有年齡依賴性,即年輕供體EPCs移植促進血管內皮損傷再內皮化的作用更明顯,老齡供體EPCs該效應不明顯。衰老導致EPCs的功能受損、數(shù)量減少,可能是老年患者血管損傷后再內皮化能力下降的原因。如何有效抑制EPCs衰老,促進老年患者損傷血管有效再內皮化成為目前急需解決的問題。
　　 Klotho(K1)基因是Kuro等在1997年發(fā)現(xiàn)的與衰老相關的新基因。K1基因在小鼠中的表達缺失導致類似

6、于人類衰老的各種表型變化,例如動脈內膜增厚、中膜鈣化、動脈硬化和骨質疏松、肺氣腫、糖和能量代謝異常等。K1基因主要在腎遠曲小管上皮細胞上表達。
　　 目前,K1預防衰老的機制尚不十分清楚,有研究證實在K1基因變異的小鼠,隨著機體的逐漸衰老,骨髓、外周血EPCs數(shù)量會明顯降低,提示K1基因表達水平與EPCs關系密切。本課題擬研究小鼠增齡對K1表達的影響,探討K1對EPCs數(shù)量、生物學功能及其參與血管損傷后再內皮化的影響,初窺K1抑

7、制EPCs衰老的可能的信號通路。
　　 2.方法:
　　 2.1小鼠增齡與K1表達水平及EPCs功能的關系
　　 2.1.1檢測不同月齡小鼠EPCs數(shù)量和功能
　　 雄性C57BL/6小鼠,按照月齡分為2月齡、12月齡、20月齡三組。采用內皮細胞選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)和誘導分化密度梯度離心法獲的小鼠骨髓源性單個核細胞,以獲得小鼠骨髓源性EPCs,并分別通過aeLDL-DiI和FITC-UEA-I熒光雙染鑒定、流

8、式細胞儀檢測細胞表面干細胞抗原及內皮細胞特異性抗原鑒定,和用免疫組化法檢測細胞表面內皮細胞特異性抗原來鑒定。分別采用acLDL-DiI和FITC-UEA-I熒光雙陽性細胞計數(shù)、MTT分析、改良的Boyden小室、黏附細胞計數(shù)來檢測不同年齡EPCs數(shù)量、增殖、遷移和黏附能力。
　　 2.1.2檢測不同月齡小鼠腎臟K1mRNA和外周血K1蛋白水平
　　 采用RT-PCR法檢測不同月齡小鼠腎臟K1 mRNA的表達,用Weste

9、rn-blot法檢測不同月齡小鼠外周血K1蛋白水平,分析不同月齡小鼠K1水平與EPCs數(shù)量及功能的相關性。
　　 2.2 K1對老齡小鼠EPCs部分生物學功能的影響
　　 2.2.1觀察K1對體外培養(yǎng)的老齡小鼠EPCs部分生物學功能的影響
　　 20月齡小鼠骨髓源性EPCs與不同濃度的K1蛋白孵育,分別采用acLDL-DiI和FITC-UEA-I熒光雙陽性細胞計數(shù)、MTT分析和改良的Boyden小室法來檢測其數(shù)量

10、、增殖、遷移能力的變化。
　　 2.2.2初步探討K1抑制EPCs衰老的可能的信號通路
　　 采用Western-blot法檢測不同濃度K1孵育老齡小鼠p53、p21的表達和Akt的磷酸化水平,分析K1影響EPCs衰老的機制。
　　 2.3 K1促進老齡小鼠損傷血管再內皮化的研究
　　 主要觀察K1對老齡小鼠血管損傷后EPCs動員及修復損傷內皮的影響。采用非顯微外科法建立小鼠(20月齡)頸動脈損傷模型。在

11、小鼠頸動脈損傷后各時點(術前、術后1天、術后3天、術后7天和術后14天)獲取外周血,采用流式細胞儀檢測外周血EPCs數(shù)量。在小鼠頸動脈損傷后第3天,采用流式細胞儀檢測K1處理組、K1抗體處理組外周血EPCs的數(shù)量;14天后通過Evans blue染色檢測損傷動脈再內皮化情況,通過HE染色檢測損傷動脈新生內膜增生情況。
　　 3.結果
　　 第一部分:培養(yǎng)7天的小鼠骨髓單個核細胞呈梭形或紡錘狀,與內皮細胞形態(tài)相似,絕大多數(shù)

12、細胞可攝取acLDL-DiI和與UEA-I結合,流式細胞儀檢測顯示這些細胞既有干細胞抗原Sca-1的高表達,又有內皮特異性標記物VEGFR-2的高表達,免疫組化檢測顯示這些細胞還高表達內皮特異性標記物vWF。熒光雙染計數(shù)2M、12M、20M月齡小鼠EPCs數(shù)量,發(fā)現(xiàn)隨著月齡的增加,EPCs數(shù)量明顯減少。采用MTT法檢測不同月齡小鼠骨髓源性EPCs增殖能力,用Boyden遷移小室法測定其遷移能力,用粘附細胞計數(shù)測量其粘附能力,結果發(fā)現(xiàn),隨

13、著月齡的增加,小鼠骨髓源性EPCs的粘附功能、遷移功能、增殖功能明顯下降。分別采用RT-PCR和Western-blot法檢測不同月齡小鼠腎臟K1mRNA和外周血K1蛋白水平,結果顯示K1mRNA和外周血K1蛋白水平隨著月齡的增加而顯著性降低。同時分析顯示K1水平與EPCs的數(shù)量和粘附功能、遷移功能和增殖功能具有相關性。
　　 第二部分:體外細胞培養(yǎng)實驗中,熒光雙染計數(shù)顯示,K1刺激濃度依賴性增加老齡小鼠骨髓單個核細胞分化成EP

14、Cs的數(shù)量;MTT分析顯示,K1刺激濃度依賴性增強EPCs的增殖能力;改良的Boyden小室分析顯示,K1濃度依賴性增加遷移的EPCs數(shù)量。
　　 采用Western-blot法測定不同濃度的K1蛋白處理后的EPCs細胞的p53/p21表達水平,發(fā)現(xiàn)p53/p21呈K1蛋白濃度依賴性下降;以P-Akt與Akt的比值來代表EPCs Akt磷酸化的水平,發(fā)現(xiàn)Akt的磷酸化水平隨著K1蛋白濃度的增加而逐漸下降。
　　 第三部分

15、:非顯微外科手術方法損傷小鼠頸動脈后,取損傷動脈Evans blue染色觀察,損傷動脈內皮完全剝脫。小鼠頸動脈損傷后,采用流式細胞儀檢測外周血EPCs數(shù)量顯示,小鼠頸動脈損傷后1天、3天和7天,外周血EPCs數(shù)量明顯高于假手術組,外周血EPCs數(shù)量在動脈損傷后3天達到高峰。采集術后第3天K1處理組和K1抗體處理組小鼠的外周血,檢測其EPCs數(shù)量,結果顯示:與頸動脈損傷組相比較,K1處理組的循環(huán)K1明顯升高,而K1抗體處理組無明顯上升。術

16、后第14天,損傷血管Evans blue染色顯示,在K1處理組,損傷血管再內皮化的面積明顯高于對照頸動脈損傷組,K1抗體處理組的再內皮化的面積與頸動脈損傷組相比無明顯差異。HE染色后應用Image ProPlus軟件用來測量新生內膜、中膜面積,利用內膜面積和中膜面積的比值來評價內膜新生,結果顯示,K1處理組內膜增生程度較對照組及K1抗體處理組明顯降低。
　　 4.結論
　　 4.1不同月齡小鼠腎臟K1 mRNA表達、外周

17、血K1蛋白水平與EPCs的數(shù)量、遷移、增殖、黏附功能相關,且隨小鼠月齡的增加下降;
　　 4.2在本研究濃度范圍內,K1蛋白可能參與體外培養(yǎng)的老齡小鼠骨髓單個核細胞分化,促進骨髓單個核細胞分化成為EPCs,呈濃度依賴性提高其遷移能力和增殖能力;
　　 4.3在本研究濃度范圍內,K1蛋白可濃度依賴性降低體外培養(yǎng)的EPCs的p53/p21的表達以及Akt的磷酸化水平,可能部分通過下調Akt活性,降低p53/p21水平,抑制細