老齡小鼠胸腺輻射損傷效應(yīng)和分子機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　胸腺是免疫系統(tǒng)中重要的中樞免疫器官，是T淋巴細(xì)胞分化、發(fā)育、成熟為的場(chǎng)所和自身免疫耐受的中心，并且分泌多種肽類激素參與免疫調(diào)節(jié)。青春期后胸腺隨著年齡增長(zhǎng)發(fā)生明顯萎縮的現(xiàn)象，稱為增齡性胸腺萎縮。其特征為腺體變小，重量減輕，細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，脂肪細(xì)胞積累，胸腺細(xì)胞增殖能力下降。增齡性胸腺萎縮主要由胸腺微環(huán)境的改變所引起，胸腺微環(huán)境是一個(gè)高度異質(zhì)性的三維網(wǎng)絡(luò)，主要由胸腺基質(zhì)細(xì)胞(TSC)和胸腺細(xì)胞兩部分構(gòu)成，TSC主要是胸腺上皮

2、細(xì)胞(TEC)，胸腺細(xì)胞即胸腺內(nèi)的淋巴細(xì)胞。TEC可通過(guò)兩種方式促進(jìn)胸腺細(xì)胞的發(fā)育，其一，分泌細(xì)胞因子促進(jìn)胸腺細(xì)胞的增殖和分化，胸腺細(xì)胞在胸腺皮質(zhì)內(nèi)會(huì)受到細(xì)胞因子的廣泛影響，這些細(xì)胞因子是誘導(dǎo)胸腺細(xì)胞亞群的克隆增殖、分化和成熟過(guò)程所必需的。其二，TEC與胸腺細(xì)胞的接觸，兩者表面的受體與配體相互作用，導(dǎo)致胸腺細(xì)胞增殖和發(fā)育。到了中老年，增齡性胸腺萎縮比較嚴(yán)重，胸腺細(xì)胞發(fā)生明顯的退行性改變和凋亡，造成外周淋巴組織中T細(xì)胞的質(zhì)與量的異常，因而

3、增齡性胸腺萎縮勢(shì)必導(dǎo)致免疫系統(tǒng)衰老和應(yīng)答免疫系統(tǒng)功能低下，一方面增加老年人罹患癌癥、病毒細(xì)菌等病原感染的危險(xiǎn)，另一方面降低老年人對(duì)外源性損傷，如放療輻射、腫瘤化療、應(yīng)激刺激等的修復(fù)能力。
　　近年來(lái)惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率在國(guó)內(nèi)、國(guó)外均呈明顯的上升趨勢(shì)，人口老齡化是主要原因之一。放療是治療惡性腫瘤的主要手段之一，惡性腫瘤病人中約有70％在其治療的不同階段需要接受放療，因此老年人接受放療輻射的機(jī)會(huì)多于中青年人。胸腺是輻射高度敏感器官

4、，胸部腫瘤（如乳腺癌、肺癌、食道癌、霍奇金淋巴瘤、畸胎瘤等）的放療不可避免的造成胸腺輻射損傷而且非常多見(jiàn)。
　　近年來(lái)胸腺輻射損傷效應(yīng)的研究主要集中不同劑量的輻射對(duì)胸腺的損傷效應(yīng)，涉及眾多而復(fù)雜的分子調(diào)控系統(tǒng)。文獻(xiàn)報(bào)道，0.5Gy以上的輻射即可引起人胸腺細(xì)胞歸巢能力下降;胸腺細(xì)胞計(jì)數(shù)下降;DNA合成受抑制;胸腺細(xì)胞凋亡增加，促進(jìn)凋亡的蛋白分子表達(dá)升高等，并隨輻射劑量呈依賴性加重。輻射對(duì)TEC損傷的機(jī)制不十分清楚，文獻(xiàn)報(bào)道輻射后可引

5、起細(xì)胞信號(hào)通路的激活（如PDE7/Camp/PKA途徑）或受阻（Notch信號(hào)通路）、細(xì)胞因子IL-2、CSF、TNF等分泌異常，隨輻射劑量不同反應(yīng)不同。近年發(fā)現(xiàn)一些新的胸腺微環(huán)境在特定階段表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、細(xì)胞因子，它們參與調(diào)節(jié)胸腺的成熟、老化及胸腺細(xì)胞的分化、發(fā)育、增殖過(guò)程。例如，F(xiàn)oxn1轉(zhuǎn)錄因子在皮膚和胸腺上皮細(xì)胞所表達(dá)，是胸腺的器官發(fā)生過(guò)程中的TEC的分化和增殖所必須的。Foxn1基因的缺失在人和小鼠中都導(dǎo)致了嚴(yán)重的胸腺缺失

6、和免疫缺陷。 Foxp3轉(zhuǎn)錄因子大部分表達(dá)于胸腺CD4+CD25+Treg細(xì)胞亞群。Treg是機(jī)體維持自身免疫穩(wěn)態(tài)的重要組成部分，在抗感染免疫、腫瘤免疫、免疫排斥、免疫抑制發(fā)生及自身免疫性疾病等方面都起著非常重要作用。Foxp3決定了Treg細(xì)胞的免疫抑制功能。阻斷Foxp3表達(dá)后，Treg細(xì)胞的抑制功能明顯減低。白細(xì)胞介素-7(IL-7)最早是骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌的一種糖蛋白，也表達(dá)與胸腺。近年來(lái)的體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明IL-7不僅是早期B

7、細(xì)胞的生長(zhǎng)因子，也是胸腺早期T細(xì)胞的維持生長(zhǎng)因子。角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)屬于成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族，KGF具有廣泛的生物學(xué)活性，能促進(jìn)多種細(xì)胞中DNA的合成，能特異性地刺激上皮細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)。KGF是出生后小鼠胸腺再生的必需因素。在很多疾病模型中，KGF可以通過(guò)增加TEC數(shù)量以及恢復(fù)胸腺皮質(zhì)和髓質(zhì)結(jié)構(gòu)而發(fā)揮保護(hù)胸腺的功能。目前，這些因子在胸腺輻射后的表達(dá)規(guī)律鮮有報(bào)道，對(duì)輻射損傷的調(diào)節(jié)作用有待進(jìn)一步研究。
　　綜上，我們推測(cè)老年

8、人由于增齡性胸腺萎縮引起機(jī)體免疫功能下降，對(duì)外源性損傷的耐受、修復(fù)能力降低，因此胸腺輻射損傷效應(yīng)可能不同于中青年人。
　　本課題擬通過(guò)四部分實(shí)驗(yàn)研究老齡小鼠胸腺輻射損傷效應(yīng)及分子機(jī)制。一、監(jiān)測(cè)輻射前后老齡、中齡、青齡小鼠胸腺輸出的成熟T細(xì)胞及幼稚T細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化，二、觀察輻射前后老齡、中齡、青齡小鼠胸腺的大體及病理形態(tài)學(xué)變化。三、動(dòng)態(tài)比較輻射前后老齡、中齡、青齡小鼠胸腺TEC轉(zhuǎn)錄因子Foxn1、Foxp3和細(xì)胞因子IL-7、KGF

9、的表達(dá)差別。四、比較輻射前后老齡、中齡、青齡小鼠TEC的分化和增殖能力及不同成熟階段的胸腺細(xì)胞的變化規(guī)律。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)，明確老齡小鼠胸腺亞致死性輻射對(duì)機(jī)體免疫功能的損傷程度及自身的修復(fù)規(guī)律，從細(xì)胞和分子水平上明確了輻射后胸腺組織損傷和重建的變化規(guī)律，闡明胸腺輻射損傷與修復(fù)的分子機(jī)制，為輻射后免疫功能的重建和研究有效的防治措施，促進(jìn)老齡人口健康提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：
　　一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組
　　實(shí)驗(yàn)采用SPF

10、級(jí)C57BL/6小鼠共60只。分為三組:青齡組（4月齡）、中齡組(12月齡)、老齡組(18月齡)，每組20只。
　　二、標(biāo)本的采集與處理
　?。ㄒ唬┬∈蟮妮椛洹?br>　　取青齡組、中齡組、老齡組各10只，稱重，腹腔麻醉后，予胸腺區(qū)醫(yī)用直線加速器放療輻射。放療參數(shù):胸腺區(qū)照射野1.5×1.5cm2，源皮距100cm，X線輻射，劑量4Gy，加速器劑量率300cGy/分鐘。輻射后SPF級(jí)飼養(yǎng)室內(nèi)繼續(xù)飼養(yǎng)，分籠標(biāo)記。
　　（

11、二）小鼠的取材、處理
　　選取未輻射及輻射后3天、14天青齡組、中齡組、老齡組各5只，給予10％水合氯醛0.3ml/kg腹腔注射麻醉，無(wú)菌取胸腺及脾臟組織，提取胸腺細(xì)胞、胸腺上皮細(xì)胞、脾臟中的淋巴細(xì)胞，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。
　　三、試驗(yàn)方法及檢測(cè)指標(biāo)
　?。ㄒ唬┬∈笃⑴KT細(xì)胞FACS分析
　　采用FACS分析輻射前及輻射后3天、14天各年齡組小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD44-CD62+T細(xì)胞亞群數(shù)量、比例

12、變化。
　?。ǘ┬∈笮叵俳M織HE染色
　　選取輻射前及輻射后3天、14天各年齡組小鼠胸腺組織各1葉予HE染色。顯微鏡下觀察胸腺組織形態(tài)學(xué)改變。
　?。ㄈ┯?jì)算胸腺指數(shù)及胸腺細(xì)胞計(jì)數(shù)
　　小鼠稱其體重及胸腺重量，按公式計(jì)算胸腺指數(shù)。胸腺指數(shù)=胸腺重量(mg)/[體重(g)×10]。分離收集胸腺細(xì)胞，加入500μl PBS混勻，顯微鏡下計(jì)數(shù)。
　?。ㄋ模┬∈笮叵偌?xì)胞FACS分析
　　采用FACS分析輻射

13、前及輻射后3天、14天各年齡組小鼠胸腺細(xì)胞CD4+CD8-、CD4-CD8+、CD4+CD8+、CD4-CD8-各亞群數(shù)量、比例變化。
　　結(jié)果：
　　一、老齡、中齡、青齡組小鼠胸腺輻射前后脾臟T細(xì)胞FACS分析結(jié)果
　?。ㄒ唬┹椛淝昂罄?、中、青齡小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞百分含量和CD4+/CD8+比值。
　　1、輻射前小鼠4月、12月、18月齡間相比，脾臟CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞百分含量無(wú)差

14、異。脾臟CD4+/CD8+比值逐漸降低(P＜0.05)。
　　2、輻射后3天與輻射前相比，各年齡組的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞百分含量均明顯下降（P＜0.05），至輻射后14天，都有不同程度回升，但18月齡組回升不明顯，仍未恢復(fù)至輻射前水平(P＜0.05)。
　?。ǘ┹椛淝昂罄稀⒅?、青齡小鼠脾臟CD4+和CD8+的na(i)ve T細(xì)胞(CD62+CD44-)百分含量。
　　1、輻射前4月、12月、18月齡間小鼠

15、脾臟CD4+和CD8+的naive T細(xì)胞百分含量隨年齡增長(zhǎng)逐漸降低。
　　2、輻射后3天與輻射前相比，各年齡組的CD4+和CD8+的naive T細(xì)胞百分含量均明顯下降。至輻射后14天，都有不同程度回升，但12月齡、18月齡組CD4+的naive T細(xì)胞和18月齡組CD8+的naive T細(xì)胞回升不明顯，仍未恢復(fù)至輻射前水平(P＜0.05）。
　　二、胸腺輻射前后老齡、中齡、青齡組小鼠胸腺組織形態(tài)學(xué)結(jié)果
　　（一）輻

16、射前后老齡、中齡、青齡組小鼠胸腺組織形態(tài)學(xué)的變化
　　小鼠年齡的增加，胸腺組織明顯逐漸萎縮，顏色由乳白變黃白、表面光澤度下降。HE染色圖片，可見(jiàn)隨著年齡的增加，小鼠胸腺皮質(zhì)變薄，細(xì)胞稀疏，皮髓質(zhì)分界不清，脂肪組織浸潤(rùn)。輻射后3天，各年齡組小鼠胸腺組織均進(jìn)一步明顯萎縮。HE染色圖片見(jiàn)年齡組小鼠胸腺均可見(jiàn)皮髓質(zhì)細(xì)胞變形壞死，胸腺內(nèi)淋巴細(xì)胞減少，胸腺小體消失。輻射后14天，小鼠胸腺組織體積逐漸增大，HE染色圖片見(jiàn)部分區(qū)域開(kāi)始再生，但18

17、月齡小鼠胸腺組織恢復(fù)不明顯。
　　（二）輻射前后老齡、中齡、青齡組小鼠胸腺指數(shù)及胸腺細(xì)胞計(jì)數(shù)的變化
　　小鼠隨著年齡增長(zhǎng)，胸腺指數(shù)及胸腺細(xì)胞計(jì)數(shù)逐漸下降。輻射后3天，各年齡組與輻射前比較，進(jìn)一步降低(P＜0.05）。輻射后14天，4月齡及12月齡組恢復(fù)接近輻射前水平，但18月齡組恢復(fù)不明顯(P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、小鼠胸腺輻射后，機(jī)體的免疫功能經(jīng)歷損傷與重建的過(guò)程。但與中、青齡相比，老齡小鼠對(duì)輻射損

18、傷的耐受、修復(fù)能力差，存在明顯的遠(yuǎn)后效應(yīng)。
　　2、小鼠胸腺輻射后胸腺微環(huán)境也經(jīng)歷缺陷、修復(fù)的過(guò)程，但老齡鼠對(duì)輻射損傷明顯，輻射后胸腺微環(huán)境未見(jiàn)明顯改善。
　　3、老齡鼠胸腺輻射效應(yīng)機(jī)制是:1）輻射使CD4-CD8-的胸腺細(xì)胞發(fā)育持續(xù)阻滯，使成熟的、功能性胸腺細(xì)胞減少，導(dǎo)致輸出外周的成熟T細(xì)胞減少，機(jī)體免疫功能持續(xù)低下。2）輻射后Foxn1、Foxp3、KGF、IL-7基因在不同時(shí)間段差異表達(dá)，動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)TEC的增殖、凋亡及胸