耐輻射菌PprI蛋白的制備及其對(duì)小鼠急性輻射損傷作用的研究.pdf

1、目的：耐輻射球菌(Deinococcus radiodurans)(簡(jiǎn)稱(chēng)DR)是一種對(duì)電離輻射,紫外線,強(qiáng)氧化劑和化學(xué)誘變劑具有超強(qiáng)耐受力的極端微生物,是迄今為止地球上發(fā)現(xiàn)的抗輻射能力最強(qiáng)的生物之一。最近研究表明,負(fù)責(zé)這一抗性的開(kāi)關(guān)基因-pprI基因在DNA損傷修復(fù)中起著極為重要的作用。pprI基因可作為一個(gè)保護(hù)開(kāi)關(guān)基因誘導(dǎo)DNA修復(fù)基因如recA和pprA的表達(dá),在提高細(xì)胞抗氧化能力方面,也可能通過(guò)調(diào)控過(guò)氧化氫酶的表達(dá)活性來(lái)提高抗H2

2、O2的能力。我們近年的研究表明,pprI基因轉(zhuǎn)染對(duì)哺乳動(dòng)物中子和y射線急性放射損傷具有顯著的防治作用。然而,基因轉(zhuǎn)染用于放射損傷的防治存在一定的困難和局限性。因此,本課題進(jìn)一步研究pprI基因原核表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建、PprI蛋白的表達(dá)及其純化,并將其注入受照小鼠體內(nèi),研究PprI蛋白對(duì)小鼠γ射線急性放射損傷的防治作用。耐輻射球菌pprI基因表達(dá)的PprI原核蛋白對(duì)真核生物的抗放作用,迄今尚未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道。
　　 方法：以我們已獲

3、得國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利的pCMV-HA-pprI質(zhì)粒為模板,構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-His-pprI,并轉(zhuǎn)化入E.coli BL21(DE3)RP。IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá),SDS-PAGE和Western blot鑒定表達(dá)產(chǎn)物。然后采用His-Bind樹(shù)脂和分子篩兩步法進(jìn)行蛋白純化,獲得純化的耐輻射球菌PprI融合蛋白。將PprI融合蛋白注射入ICR小鼠體內(nèi),并對(duì)PprI蛋白注射組與生理鹽水注射組分別用γ射線進(jìn)行照射,觀察急性放射

4、損傷小鼠的血細(xì)胞數(shù)目和淋巴細(xì)胞百分比,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)骨髓細(xì)胞、胸腺及脾臟淋巴細(xì)胞的凋亡率,采用CCK8檢測(cè)骨髓細(xì)胞、胸腺及脾臟淋巴細(xì)胞的增殖率,以期探討PprI蛋白對(duì)γ射線輻射損傷小鼠的抗放作用。
　　 結(jié)果：成功構(gòu)建了pET-28a-His-pprI原核表達(dá)載體,SDS-PAGE和Western blot證實(shí)表達(dá)產(chǎn)物確為6×His-PprI融合蛋白,相對(duì)分子質(zhì)量約為37KD。純化后獲得了耐輻射球菌PprI融合蛋白。PprI

5、蛋白于小鼠γ射線照射前1天、照射當(dāng)天和照射后3天以100μg／kg的劑量肌肉注射入小鼠體內(nèi)。在小鼠照后28天的觀察期間內(nèi),由外周血象觀察可見(jiàn),PprI蛋白注射組小鼠外周血血小板總數(shù)在照后第7天為482.75×109／L,顯著高于生理鹽水注射組小鼠(P＜0.05)；外周血淋巴細(xì)胞百分比在照后第1天為41.00％,第7天為47.25％,均顯著高于生理鹽水注射組小鼠(P<0.05)；由細(xì)胞凋亡檢測(cè)可見(jiàn),PprI蛋白注射組脾細(xì)胞凋亡率在第1天為

6、13.43％,第14天為24.85％,均顯著低于生理鹽水注射組小鼠(P<0.05):胸腺細(xì)胞凋亡率在第14天為8.86％,第28天為6.21％,均顯著低于生理鹽水注射組小鼠(P<0.05):骨髓細(xì)胞凋亡率在第1天為10.70％,第14天為18.74％,第28天為5.31％,均顯著低于生理鹽水注射組小鼠(P<0.05)；由細(xì)胞增殖檢測(cè)可見(jiàn),PprI蛋白注射組脾細(xì)胞A450值在第14天為0.647,第28天為1.827,均顯著高于生理鹽水注

7、射組小鼠(P<0.05)；胸腺細(xì)胞A450值在第7天為0.340,顯著高于生理鹽水注射組小鼠(P<0.05)；骨髓細(xì)胞A450值在第14天為0.539,顯著高于生理鹽水注射組小鼠(P<0.05)。
　　 結(jié)論：⑴成功構(gòu)建了耐輻射菌pprI基因的原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-His-pprI,并在E.coli中有效表達(dá)aprI融合蛋白,經(jīng)純化定量獲得較大量蛋白質(zhì)。⑵探索出較合適的PprI蛋白劑量及給藥方法:100μg／kg,肌肉注射