耐輻射奇球菌pprA與pprI基因轉(zhuǎn)移及其表達(dá)蛋白質(zhì)相互作用對(duì)真核細(xì)胞輻射抗性的影響.pdf

1、背景及目的：耐輻射奇球菌（Deinococcus radiodurans，DR）是世界上輻射抗性最強(qiáng)的生物之一，pprI基因是DR DNA損傷修復(fù)、發(fā)揮輻射抗性的關(guān)鍵基因，是DR激活損傷修復(fù)途徑的總開關(guān)。pprA基因具有 DNA損傷修復(fù)和抗氧化雙重功能，pprI在啟動(dòng)子水平調(diào)控了pprA基因的上游表達(dá)，可能通過調(diào)控recA、pprA等基因的表達(dá)來增強(qiáng)輻射保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)旨在研究耐輻射奇球菌 pprA、pprI基因轉(zhuǎn)移及其表達(dá)蛋白質(zhì)的相互

2、作用對(duì)真核細(xì)胞輻射抗性的影響，為完善DR菌抗輻射調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供基礎(chǔ)，為輻射防護(hù)基因治療提供新的思路。
　　方法：1、以實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的pGADT-7-pprA、pet28a-pprI載體為模板，構(gòu)建pEGFP-N1-pprA、pDsRed1-N1-flag-pprI熒光表達(dá)載體。脂質(zhì)體2000介導(dǎo)將pprI、pprA基因表達(dá)載體共轉(zhuǎn)入人腎上皮細(xì)胞293T，熒光顯微鏡觀察熒光蛋白表達(dá)，Western blot檢測(cè)融合蛋白表達(dá)。

3、　　2、生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)PprA與PprI蛋白的相互作用，激光共聚焦顯微鏡觀察其在細(xì)胞內(nèi)的共定位。
　　3、MTT法檢測(cè)細(xì)胞生存率，克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)克隆形成能力，化學(xué)熒光法檢測(cè)活性氧（ROS）含量，WST-1法檢測(cè)總超氧化物歧化酶（SOD）活力，微板法檢測(cè)丙二醛（MDA）含量及還原型谷胱甘肽活力，免疫熒光法檢測(cè)γ-H2AX焦點(diǎn)數(shù)。
　　結(jié)果：1、雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳顯示在4700、1000 bp處與4800、1100 b

4、p處出現(xiàn)目的條帶。測(cè)序結(jié)果顯示構(gòu)建序列與模板序列一致，無移碼突變。轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞熒光顯微鏡觀察到紅色和綠色熒光蛋白表達(dá)，48-72h熒光強(qiáng)度最大。Western blot結(jié)果顯示在不同檢測(cè)水平65 kDa及60 kDa大小處有融合蛋白表達(dá)。
　　2、STRING預(yù)測(cè)PprA與PprI蛋白具有相互作用，其可信得分為0.665分。激光共聚焦顯微鏡下觀察PprA、PprI融合蛋白主要分布在293T細(xì)胞的胞質(zhì)中，免疫熒光實(shí)驗(yàn)提示兩者存在

5、細(xì)胞內(nèi)共定位。
　　3、與未轉(zhuǎn)染的空白細(xì)胞及轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的對(duì)照組細(xì)胞相比，單轉(zhuǎn)pprI的細(xì)胞和pprA與pprI共轉(zhuǎn)的細(xì)胞輻照后生存率明顯增高，ROS含量明顯降低，輻照后細(xì)胞的GSH、SOD活力明顯增高，MDA含量明顯降低，γ-H2AX焦點(diǎn)數(shù)明顯減少（P<0.05），且雙轉(zhuǎn)組更加明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：1、pEGFP-N1-pprA，pDsRed1-N1-flag-pprI重組表達(dá)載體成功構(gòu)建。