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文檔簡介
1、背景與目的:耐輻射奇球菌(Deinococcus radiodurans, DR)是地球上已知的耐受電離輻射最強的生物之一,能夠高度耐受電離輻射、紫外線、H2O2、干燥以及其他DNA理化損傷劑的損傷。pprM基因是 DR中功能未知的獨特基因,生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn) PprM擁有CSD結(jié)構(gòu)域(“Cold-shock”DNA-binding domain),推測其可能是一種DNA結(jié)合蛋白,能夠與靶DNA結(jié)合而發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。本研究擬應(yīng)用目
2、前在體內(nèi)研究蛋白質(zhì)-DNA相互作用的最佳的方法染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(ChIP)來篩選 PprM蛋白相互作用的靶 DNA,探索PprM與它們的調(diào)控關(guān)系。
方法:本研究通過設(shè)計并合成能夠擴增 HA-pprM基因全長的引物,以無突變的pGEX-6p-1-pprM載體為模版,PCR擴增出攜帶NdeⅠ酶切位點的HA-pprM基因全長,大小約438bp,經(jīng)NdeⅠ酶切后,與pRADK載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌,經(jīng)培養(yǎng)、質(zhì)粒提取純化后,以瓊脂糖凝
3、膠電泳、酶切鑒定以及基因測序確認插入序列的正確性;將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pRADK-HA-pprM,以改良的CaC12法轉(zhuǎn)化到耐輻射奇球菌 pprM基因缺失菌株中,以表達 HA-PprM融合蛋白,并用Western blot驗證HA-PprM融合蛋白的表達。然后使用HA-tag抗體順利實施染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(ChIP)獲得與PprM蛋白質(zhì)具有相互作用的DNA混合液,分別設(shè)計4個關(guān)鍵基因的啟動子區(qū)域的PCR引物,ChIP PCR的方法檢測 D
4、NA混合液相應(yīng)的啟動子區(qū)域的結(jié)合情況。
結(jié)果:成功構(gòu)建pRADK-HA-pprM穿梭表達載體,經(jīng)測序分析,序列無任何突變;成功轉(zhuǎn)化到耐輻射奇球菌pprM基因缺失菌株中,并通過Western blot驗證回補株中能夠表達HA-PprM融合蛋白;染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)與ChIP PCR實驗結(jié)果顯示成功篩選到3個與PprM蛋白具有相互作用的靶DNA,分別是pprI、pprA、recA的啟動子。
結(jié)論:1.成功構(gòu)建了 p
5、RADK-HA-pprM穿梭表達載體,并獲得耐輻射奇球菌pprM基因缺失回補菌株;2.應(yīng)用ChIP PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)2 kGy輻照及未輻照條件下耐輻射奇球菌PprM蛋白均不與自身基因啟動子結(jié)合;未輻照條件下PprM蛋白不與pprI、recA基因啟動子結(jié)合而與pprA基因啟動子結(jié)合;2 kGy輻照條件下PprM蛋白與pprI、recA、pprA三基因啟動子均結(jié)合,且與pprA基因啟動子結(jié)合能力增強。提示PprM蛋白可能作為一種輻射應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因
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