耐輻射奇球菌RecO、RecF原核與真核表達(dá)體系的構(gòu)建及抗紫外輻射損傷效應(yīng)的研究.pdf

1、耐輻射奇球菌(Deinococcus radiodurans, Dr)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的對電離輻射、紫外線、干燥、化學(xué)誘變劑和其它一些DNA損傷因子耐受性最強的一類細(xì)菌。這種極端抗性被認(rèn)為是由于D．radiodurans具有一套高效DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)。在DNA損傷方面，5000 Gyγ射線可以在D.radiodurans每個基因組中產(chǎn)生大約200多個斷裂的DNA雙鏈片段(DNA double-strand breaks，DSBs)，大于3

2、000個斷裂的DNA單鏈片段(DNAsingle-strand breaks，SSBs)和超過1000個堿基損傷位點。在這些DNA損傷當(dāng)中，DNA雙鏈斷裂對于細(xì)胞的生存是最致命的。D.radiodurans可在數(shù)小時內(nèi)把這些DNA損傷全部修復(fù)，精確重建基因組并保持活力和性狀的穩(wěn)定。 近年來的研究結(jié)果顯示，D.radiodurans的輻射抗性源于其高效的DNA修復(fù)能力，同時電離輻射和紫外輻射產(chǎn)生大量的氧自由基，可間接造成DNA損傷

3、。因此，D．radiodurans超強的輻射抗性可能與其抗氧化能力密切相關(guān)。D．radiodurans在長期的進(jìn)化過程中形成的氧化防御體系，包括酶類和非酶類。它們能清除氧自由基，參與抗氧化系統(tǒng)的調(diào)控，有效防止自由基所致的DNA損傷，表現(xiàn)出超強抗氧化和耐輻射能力。對D．radiodurans極端抗性和DNA損傷修復(fù)機制的研究，將有利于更好的研究腫瘤細(xì)胞的發(fā)病機制和尋找抗輻射藥物，并可將其用于輻射污染環(huán)境的修復(fù)。 ReeFOR途徑

4、是D．radiodurans同源重組特有的修復(fù)途徑。本研究擬選擇參與D．radiodurans重組修復(fù)ReeFOR途徑的兩個關(guān)鍵基因recO和recF，分別構(gòu)建D．radiodurans RecO租ReeF原核和真核表達(dá)體系，觀察目的基因在宿主受到紫外輻射時的防護效應(yīng)，為后續(xù)紫外生物防護的研究提供實驗依據(jù)。 一、耐輻射奇球菌(Deinococcus radiodurans, Dr)RecO和ReeF原核表達(dá)體系的建立 1

5、．根據(jù)GenBank收錄的D．radiodurans(Dr)基因序列recO(DR0819)和recF(DR1089)編碼區(qū)，應(yīng)用Primer5．0分別設(shè)計特異性引物，以D．radiodurans基因組為模板，PCR擴增recO和recF全長基因。將得到的PCR片段T-A克隆于pGEM-T載體，測序驗證。 2．將測序驗證的recO和recF連接于表達(dá)載體pET30b(+)，轉(zhuǎn)化構(gòu)建的原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET30b(+)-recO和

6、pET30b(+)-recF至E.coli BL21(DE3)。 3．優(yōu)化RecF、RecO蛋白誘導(dǎo)條件：選擇不同的IPTG濃度、不同的誘導(dǎo)時間及溫度對蛋白表達(dá)量的影響，確定蛋白誘導(dǎo)的最佳條件。研究表明，IPTG濃度為0．3 mM，16℃誘導(dǎo)過夜，RecF融合蛋白表達(dá)量最高；IPTG濃度為0．1 mM，37℃誘導(dǎo)2～3 h，ReeO融合蛋白表達(dá)量最高。 4．接受UVC輻照后E.coli pET30b(+)-recO、E.

7、coli pET30b(+)-recF、E.coli BL21(DE3)和E.coli pET30b(+)的生存率都受到抑制，從接受50 J/cm2 UVC輻照開始E.colipET30b(+)-recF的生存率明顯高于其它三株菌；E.coli pET30b(+)-recO能耐受UVC的輻照劑量顯著低于E.coli pET30b(+)-recF，但明顯高于另外兩株菌。RecF的保護作用強于RecO。 二、轉(zhuǎn)染recO或recF基

8、因的人皮膚成纖維細(xì)胞抗UVB損傷效應(yīng)的研究 1．建立轉(zhuǎn)染人皮膚成纖維細(xì)胞模型：采用胰酶消化法體外分離和培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞(HSF)。在細(xì)胞分離后第3天，消化細(xì)胞傳代，HE染色觀察成纖維細(xì)胞的純度。染色后鏡下可見細(xì)胞邊緣清晰，包體呈梭狀或多角形，核仁清晰，胞核凸起明顯。通過測定生長曲線，確定分離后4～7天為其對數(shù)生長期，此階段細(xì)胞生長活躍，繁殖旺盛，適合后續(xù)輻照實驗對細(xì)胞數(shù)量的要求。 用脂質(zhì)體法將構(gòu)建的pcDNA3．1-

9、NT-GFP Fusion TOPO-recO和pcDNA3．1-NT-GFPFusion TOPO-recF重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)HSF，通過MTT檢測未轉(zhuǎn)染HSF增殖活性變化確定0、30、90、120 mJ/cm2 UVB為實驗劑量。 2．MTT法測定細(xì)胞生長曲線：共設(shè)4個實驗組(轉(zhuǎn)染recO未輻照組、轉(zhuǎn)染recO輻照組、轉(zhuǎn)染recF未輻照組、轉(zhuǎn)染recF輻照組)和3個對照組(未轉(zhuǎn)染未輻照組、未轉(zhuǎn)染輻照組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒輻照組)

10、開展MTT實驗，結(jié)果顯示：未轉(zhuǎn)染未輻照組、轉(zhuǎn)染recO未輻照組、轉(zhuǎn)染recF未輻照組生長曲線無顯著性差異。轉(zhuǎn)染recO輻照組和轉(zhuǎn)染recF輻照組細(xì)胞增殖活性在接受90 mJ/cm2 UVB輻照后第4天開始恢復(fù)，與未轉(zhuǎn)染未輻照組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒輻照組有顯著性差異(P<0．05)。盡管接受90 mJ/cm2 UVB輻照后轉(zhuǎn)染recO輻照組和轉(zhuǎn)染recF輻照組細(xì)胞增殖活性能在一定程度上恢復(fù)，相較于未受輻照的細(xì)胞來說被輻照細(xì)胞的增殖活性受到強烈抑制

11、。 3．RecF和RecO轉(zhuǎn)染組輻照損傷形態(tài)學(xué)比較：未轉(zhuǎn)染HSF接受不同劑量UVB輻照后24 h，細(xì)胞表現(xiàn)出不同程度的損傷，以120 mJ/cm2 UVB損傷作用最為強烈。HSF經(jīng)UVB照射30 mJ/cm2后，細(xì)胞逐漸變圓，腫脹，細(xì)胞出現(xiàn)空泡；照射劑量增加至90 mJ/cm2后細(xì)胞碎片和死亡細(xì)胞急劇增加。此外，在同一中等UVB輻照劑量下(≥90 mJ/cm2)，隨培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞受損程度加重，具有明顯時效關(guān)系。未轉(zhuǎn)染未輻照

12、組及轉(zhuǎn)染recO未輻照組和轉(zhuǎn)染recF未輻照組細(xì)胞形態(tài)無異。90 mJ/cm2 UVB輻照后轉(zhuǎn)染recO輻照組和轉(zhuǎn)染recF輻照組細(xì)胞形態(tài)開始發(fā)生變化，以最初的梭形或多角形變?yōu)椴灰?guī)則形狀，胞漿中空泡化明顯，胞間的縫隙增大，但未見明顯的細(xì)胞碎片和死亡細(xì)胞。該結(jié)果提示轉(zhuǎn)染recO或轉(zhuǎn)染recF能在一定程度上減緩由UVB輻照引發(fā)的HSF凋亡。 5．細(xì)胞抗損傷能力檢測：培養(yǎng)液中LDH可作為反映細(xì)胞早期損傷比較敏感的指標(biāo)之一，存在于細(xì)胞漿

13、中。當(dāng)離體培養(yǎng)的細(xì)胞受到某些因素刺激時，細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變LDH可以從細(xì)胞中漏出。用選定UVB劑量輻照HSF后在24 h、48 h、72 h三個時相點檢測培養(yǎng)液中LDH濃度。UVB在低劑量時，對未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞即有損傷作用，引起LDH向細(xì)胞外滲透，高劑量時更為明顯。轉(zhuǎn)染recO和recF組LDH含量與未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組相比在UVB照射后24 h無明顯差異(P>0．05)，在照射后48～72 h轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組與轉(zhuǎn)染recF組(P<0．01

14、)和轉(zhuǎn)染recO組(P<0．05)LDH有顯著性差異。 6．細(xì)胞抗氧化能力檢測：SOD活力高低可間接反映細(xì)胞清除氧自由基的能力，MDA是脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)物，其含量的高低間接反映了細(xì)胞脂質(zhì)過氧化程度和細(xì)胞受自由基攻擊后的損傷程度。體外分離培養(yǎng)HSF在接受30 mJ/cm2 UVB輻照后，細(xì)胞存活率和T-SOD的活力呈劑量依賴性的下降，而LDH和MDA的含量呈劑量依賴性升高。輻照后24～72 h，轉(zhuǎn)染recO和recF都能在一定程度

15、上緩解了UVB引起的細(xì)胞T-SOD下降，MDA升高，增殖活力下降，提高了HSF細(xì)胞清除氧自由基的能力。 7．細(xì)胞抗炎能力檢測：在活體皮膚組織中，防御外界刺激主要依靠的人皮膚角化細(xì)胞(HKC)能接受外界刺激后開始激活細(xì)胞內(nèi)的信號傳遞系統(tǒng)。HKC在受到紫外線刺激后開始分泌IL-1α，間接誘導(dǎo)包括HSF在內(nèi)的多種細(xì)胞生成IL-6。TNF-α是誘發(fā)腫瘤和調(diào)控機體免疫反應(yīng)的關(guān)鍵因子，與UVB輻射引起的皮膚損傷、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等密切相關(guān)

16、。本實驗中UVB對未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組及轉(zhuǎn)染recO和recF組細(xì)胞中IL-6和TNF-α分泌的結(jié)果表明UVB輻照能促進(jìn)離體細(xì)胞IL-6及TNF-α的分泌增加，分泌量在一定范圍內(nèi)隨照射劑量升高而呈上升趨勢。轉(zhuǎn)染recO和recF后HSF細(xì)胞IL-6分泌明顯低于接受同等輻射劑量的未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組。 綜上所述，本研究將D.radiadurans的recF和recO克隆于pET30b(+)表達(dá)載體，使其表達(dá)處于T7噬菌體強啟動

17、子轉(zhuǎn)錄和翻譯的信號控制之下，IPTG誘導(dǎo)在宿主菌Ecoli BL21(DE3)中高效表達(dá)，初步建立了recO和recF表達(dá)體系。體外實驗初步驗證了RecO和RecF能提高E.coli對紫外線的抵抗能力。用脂質(zhì)體法將構(gòu)建的pcDNA3．1-NT-GFP Fusion TOPO-recO和pcDNA3．1-NT-GFP Fusion TOPO-recF重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的HSF，分別觀察轉(zhuǎn)染HSF抗UVB損傷的效應(yīng)。結(jié)果提示：轉(zhuǎn)染HSF

18、中的recF和recO均能增強細(xì)胞對氧自由基的清除能力，抑制細(xì)胞脂質(zhì)過氧化來緩解UVB對細(xì)胞造成的損傷，增加細(xì)胞對UVB損傷的抵抗能力。其中轉(zhuǎn)染reeF組細(xì)胞的生存率、抗氧化及抗損傷效應(yīng)明顯強于轉(zhuǎn)染recO組細(xì)胞，其具體機制還有待進(jìn)一步深入研究。 目前國內(nèi)外對D．radiodurans抗輻射效應(yīng)的研究主要集中在電離輻射損傷。本研究通過構(gòu)建D.radiodurans高效蛋白表達(dá)體系；轉(zhuǎn)染recF與recO至人皮膚成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)