生長抑素原核真核雙表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定及作用機(jī)理研究.pdf

1、原核真核雙表達(dá)系統(tǒng)與單一的原核或真核表達(dá)系統(tǒng)相比,具有較大的優(yōu)勢,可以同時(shí)啟動原核和真核雙表達(dá)外源基因。以減毒豬霍亂沙門氏菌為運(yùn)載菌的原核真核雙表達(dá)系統(tǒng),可以同時(shí)在細(xì)菌和真核細(xì)胞中表達(dá)同一蛋白質(zhì),且原核表達(dá)產(chǎn)物可以刺激機(jī)體免疫應(yīng)答；同樣,真核表達(dá)質(zhì)粒在機(jī)體中的表達(dá)產(chǎn)物也可以刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)。因此,理論上原核和真核雙表達(dá)質(zhì)?？梢源碳C(jī)體提高其免疫應(yīng)答能力。
　　 本研究應(yīng)用基因克隆、細(xì)胞培養(yǎng)、RT-PCR、SDS-PAGE

2、、Western blot和ELISA等技術(shù),將原核啟動子Ptrc片段克隆到非抗性篩選生長抑素真核表達(dá)質(zhì)粒pGS/2SS-M4GFP-asd,構(gòu)建生長抑素原核真核雙表達(dá)質(zhì)粒pPtrc-S/2SS-M4GFP-asd,分別轉(zhuǎn)化asd-大腸桿菌X6097和crp-/asd-雙缺失減毒豬霍亂沙門氏菌C500,得到X6097(pPtrc-S/2SS-M4GFP-asd)和C500(pPtrc-S/2SS-M4GFP-asd)工程菌。接著對pPt

3、rc-S/2SS-M4GFP-asd質(zhì)粒和C500(pPtrc-S/2SS—M4GFP-asd)工程菌進(jìn)行原核、真核表達(dá)鑒定。將重組菌免疫4周齡昆明小鼠,檢測小鼠血漿中抗SS抗體和抗C500水平,旨在探討以減毒豬霍亂沙門氏菌為載體的生長抑素原核真核雙表達(dá)質(zhì)粒的免疫效力,為提高現(xiàn)有生長抑素基因疫苗的免疫效果,開發(fā)高效、安全的促生長疫苗奠定理論基礎(chǔ),并提供技術(shù)支撐。.
　　 1.生長抑素原核真核雙表達(dá)質(zhì)粒pPtrc—S/2SS—M4

4、GFP-asd的構(gòu)建與篩選
　　 人工合成啟動子Ptrc序列片段,將其亞克隆入pGS/2SS-M4GFP-asd真核表達(dá)質(zhì)粒CMV啟動子下游,成功構(gòu)建了生長抑素原核真核雙表達(dá)質(zhì)粒(pPtrc-S/2SS-M4GFP-asd)；分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌X6097和減毒豬霍亂沙門氏菌C500,經(jīng)雙酶切和測序鑒定結(jié)果表明,基因的插入位點(diǎn)、方向和序列完全正確,成功得到分別以大腸桿菌X6097(pPtrc-S/2SS-M4GFP-asd)和減毒豬

5、霍亂沙門氏菌C500(pPtrc-S/2SS-M4GFP-asd)為載體的工程菌各1株。
　　 2.生長抑素原核真核雙表達(dá)質(zhì)粒pPtrc-S/2SS-M4GFP-asd的表達(dá)與鑒定
　　 將構(gòu)建好的生長抑素工程菌C500(pPtrc—S/2SS-M4GFP-asd)經(jīng)異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)和非IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)3h后,培養(yǎng)物中檢出S/2SS—M4GFP融合蛋白,大小為55KDa；用Western bl

6、ot方法鑒定證明,表達(dá)的融合蛋白可與抗生長抑素抗體結(jié)合；將生長抑素原核真核雙表達(dá)質(zhì)粒pPtrc-S/2SS-M4GFP-asd轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞,48h后觀察到綠色熒光,RT-PCR檢測證實(shí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物有S片段(352bp)、S/SS片段(491bp)和S/2SS(795bp),表明該質(zhì)粒既可在原核細(xì)胞又可在真核細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。
　　 3.生長抑素原核真核雙表達(dá)重組菌免疫對小鼠免疫應(yīng)答和生長的影響
　　 將生長抑素原核真核雙

7、表達(dá)C500(pPtrc-S/2SS-M4GFP-asd)工程菌分三個(gè)免疫劑量(高劑量0.2x1010CFU/只,中劑量0.2×109CFU/只,低劑量0.2x108CFU/只)免疫雌性昆明小鼠。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)階段,高劑量組增重分別比中劑量組、低劑量組和真核對照組(pGS/2SS-M4GFP-asd)提高5.5％、8.2％和7.1％,但組間差異不顯著(P>0.05),且高劑量組料肉比最低(25.9:1)。初免后3w高劑量組產(chǎn)生了高于真核對照

8、組6.7％的IgG抗體效價(jià)；加強(qiáng)免疫后高劑量組IgG抗體效價(jià)比真核對照組提高8.2％。初免后3w高劑量組比真核對照組IgG1抗體效價(jià)提高25％,但kG1>IgG2α,表明免疫疫苗菌后機(jī)體傾向于產(chǎn)生Th2型免疫應(yīng)答,以介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)為主。由此說明,生長抑素原核真核雙表達(dá)質(zhì)粒pPtrc-S/2SS-M4GFP-asd與生長抑素基因疫苗pGS/2SS-M4GFP-asd相比,能夠引起更強(qiáng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)尤其是體液免疫反應(yīng),從而更好地促進(jìn)機(jī)體生