耐輻射奇球菌PprM蛋白相互作用RNA的篩選及鑒定.pdf

1、研究背景：耐輻射奇球菌（Deinococcus radiodurans，DR）是目前地球上發(fā)現(xiàn)的最具有電離輻射抗性的生物之一，它對于電離輻射、紫外線、H2O2、干燥以及其他一些因素所導致的DNA和蛋白質的損傷都具有極強的耐受與抵抗能力。DR這種極強的抗性自其發(fā)現(xiàn)以來一直是人們的研究熱點，但至今具體機制仍然不是很清楚。有研究表明PprM蛋白對耐輻射奇球菌的極端輻射抗性具有重要作用。生物信息學分析結果顯示PprM蛋白與冷休克蛋白具有很高的同

2、源性，擁有多個RNA結合結構域，提示其可能是一種 RNA結合蛋白，通過與目標RNA結合發(fā)揮相應的生物學效應。
　　研究目的：為了研究PprM蛋白與RNA之間的相互作用，本研究擬構建pprM過表達載體，轉化大腸桿菌BL21，分離純化獲得PprM融合蛋白，利用RNA pull-Down技術篩選與PprM蛋白質具有相互作用的RNA，并利用EMSA和生物信息學方法驗證兩者的相互作用。
　　研究方法：本研究通過構建pGEX-6p-1-

3、pprM過表達載體，轉化大腸桿菌BL21，用IPTG誘導GST-PprM融合蛋白表達，利用GST瓊脂糖凝膠分離純化帶有GST標簽的PprM蛋白；將純化后的PprM蛋白與GST瓊脂糖凝膠偶聯(lián)，然后與耐輻射奇球菌的總RNA充分孵育，進行RNA pull-Down實驗，通過多次洗脫，獲得與PprM蛋白具有相互作用的RNA；將獲得的靶RNA兩端連接上特異性的寡核苷酸接頭，逆轉錄成cDNA后，PCR擴增，并進行TA克隆，構建RNA子文庫，挑取單克

4、隆進行測序分析，鑒定靶RNA種類，并利用EMSA和生物信息學的方法驗證兩者的相互作用。
　　結果：成功構建pGEX-6p-1-pprM過表達載體，經測序分析，插入位置正確，序列沒有突變；利用IPTG成功誘導GST-PprM蛋白的表達，并通過親和層析成功獲得高純度的PprM融合蛋白；通過RNA pull-Down實驗成功篩選到4個與PprM蛋白具有相互作用的靶RNA；通過生物信息學的方法預測表明PprM蛋白與4個RNA均具有相互作用