一種新的hTERT相互作用蛋白的篩選及鑒定.pdf

1、目的和意義:
　　端粒-端粒酶與細胞增殖、分化及衰老等增齡相關性疾病密切相關。端粒封閉染色體末端并維持染色體的穩(wěn)定性,它隨細胞分裂增殖而成比例的丟失,從而導致細胞衰老及死亡;端粒酶的活化,可以以其自身RNA組分(Human telomerase RNA,hTR)為模板,通過端粒酶催化亞單位(Human telomerase reverse transcriptase,hTERT)催化合成并延長端粒,補償端粒的丟失,維持基因組的穩(wěn)定

2、,從而滿足機體補充、修復及更新的需要。端粒酶的活性決定端粒的長度進而控制細胞的命運,其活性異?？梢允辜毎蛲鍪Э?、失衡或永生化,進而可導致一系列增齡性疾病,如動脈硬化性心腦血管疾病、2型糖尿病、原發(fā)性骨質疏松癥和腫瘤等。因此,端粒酶活性調(diào)控已成為目前的研究熱點:誘導端粒酶活性,可以延長正常細胞增殖和壽命,抑制端粒酶活性,可以導致異常細胞凋亡和衰老。進一步深入了解端粒酶活性調(diào)控機制可以為增齡相關性疾病的發(fā)病機理和防治機制以及制備治療性生物

3、工程細胞和干細胞等研究提供新的思路和線索。
　　端粒酶的活性調(diào)控是涉及多因子參與多水平調(diào)節(jié)的復雜過程,hTERT是端粒酶活性的必需組分和關鍵限速成分,其調(diào)控涉及hTERT基因的轉錄,hTERTmRNA的適當剪接,hTERT蛋白質翻譯后修飾,細胞內(nèi)轉運以及將全長的hTERT蛋白組裝為全酶等,這一系列細胞內(nèi)生物事件的正常發(fā)揮依賴于hTERT和其結合蛋白的相互作用,對hTERT相互作用蛋白的挖掘研究,有助于更深入探索端粒酶的結構功能以及

4、活性調(diào)控作用機制。蛋白質組學技術和生物質譜技術的迅速發(fā)展及其有效結合,為研究蛋白質相互作用提供了強大手段,其準確性高與速度快的優(yōu)點使免疫共沉淀聯(lián)合質譜分析技術已被廣泛應用于尋找生理條件下新的相互作用。本課題研究將免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)與串聯(lián)芯片液相質譜(High Pressure Liquid Chromatography,Chip Hermeticity In Plastics,Mass

5、 Spectrum,HPLC-CHIP-MS-MS)有效結合,鑒定出新的hTERT相互作用蛋白原鈣粘附蛋白10(Protocadherin10,PCDH10),并對兩者的相互作用所介導的端粒酶活性和腫瘤細胞生物學特性等生物學效應進行初步研究。
　　主要研究內(nèi)容和結果:
　　1.免疫共沉淀聯(lián)合質譜技術篩選hTERT相互作用蛋白1.1hTERT免疫共沉淀復合物的獲取、分離和質譜鑒定
　　首先獲取經(jīng)行“雙側睪丸切除術”的前列

6、腺癌患者的新鮮睪丸組織,病理證實為正常睪丸組織;Lysis/WashBuffer裂解獲得睪丸組織總蛋白;采用Co-IPKit利用抗人hTERT單抗免疫共沉淀睪丸組織總蛋白(以IgG為對照抗體),獲得hTERT免疫共沉淀復合物;經(jīng)WesternBlotting證實免疫共沉淀復合物中hTERT的存在,而對照組中沒有,同時經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離hTERT免疫共沉淀復合物,考馬斯亮藍染色顯示與對照組IgG相比,有hTERT蛋白條帶(約1

7、20KD)及目的特異性條帶存在,證明此法可行;切取2條差異條帶經(jīng)膠內(nèi)酶解后,通過HPLC-CHIP-MS-MS在高可信度Valid模式下鑒定為PCDH10和SP1。SP1為已報道的hTERT激活的關鍵轉錄因子,因此我們選擇新的hTERT相互作用蛋白PCDH10進行下一步研究。
　　1.2hTERT和PCDH10相互作用的免疫共沉淀體內(nèi)驗證
　　分別選用抗人hTERT單抗(或抗人PCHD10單抗)進行Co-IP(以不加抗體為對

8、照),然后以抗人PCHD10單抗(或抗人hTERT單抗)進行WesternBlotting檢測,結果顯示以hTERT單抗免疫共沉淀復合物中有PCDH10的存在,而以PCDH10單抗免疫共沉淀復合物中有hTERT的存在,再一次驗證兩者的相互作用,證明質譜結果的真實性。
　　2.PCDH10和hTERT相互作用對端粒酶活性的影響2.1腺病毒Ad-PCDH10的構建、包裝及擴增
　　采用RT-PCR從睪丸組織中擴增PCDH10基因

9、全長片段,連接至中間載體pTA2,經(jīng)酶切及測序鑒定正確;KpnI和XbaI同時雙酶切PCDH10的基因序列和腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV,T4連接酶連接后連接產(chǎn)物轉化感受態(tài)DH5α,獲取重組腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV-PCDH10;經(jīng)PmeI線性化后在含pAdEasy-1的大腸桿菌BJ5183感受態(tài)中進行同源重組,獲得重組腺病毒載體pAdEasy-PCDH10;轉染293T細胞進行包裝、擴增,第5代獲得滴度較高的腺

10、病毒,命名為Ad-PCDH10。
　　2.2PCDH10和hTERT相互作用對端粒酶活性的影響
　　以端粒酶強陽性的體外培養(yǎng)腫瘤細胞為研究對象,腺病毒Ad-PCDH10和腺病毒空載Ad感染人胰腺癌細胞HS766T,同時設置未感染對照組。Real-TimePCR和WesternBlotting分別檢測HS766T細胞中PCDH10的mRNA和蛋白表達水平表明:轉染PCDH10基因后,與腺病毒空載對照組和未感染對照組相比,PCD

11、H10基因表達明顯上調(diào),蛋白表達明顯增強(P<0.01),證明腺病毒感染有效。
　　(1)Real-TimePCR和WesternBlotting分別檢測HS766T細胞中hTERT的mRNA和蛋白表達水平表明:轉染PCDH10基因后,hTERT的mRNA和蛋白表達水平較腺病毒空載對照組和未感染對照組無明顯變化(P>0.05),表明PCDH10對hTERT的表達沒有影響;
　　(2)以抗人PCDH10單抗免疫共沉淀HS766

12、T細胞總蛋白,WesternBlotting檢測hTERT存在于轉染PCDH10的免疫共沉淀復合物中,同時TRAP-非變性PAGE-銀染法檢測端粒酶活性提示:轉染PCDH10基因組的端粒酶活性較腺病毒空載對照組和未感染對照組明顯降低(P<0.01),而后兩者端粒酶活性無明顯差異(P>0.05),表明PCDH10與hTERT相互作用能明顯抑制端粒酶活性。
　　3.PCDH10對腫瘤細胞增殖、周期、遷移和侵襲等生物學特性的影響

13、　　腺病毒Ad-PCDH10和腺病毒空載Ad感染HS766T,同時設置未感染對照組。3.1PCDH10轉染對HS776T細胞增殖活性的影響
　　轉染PCDH10基因24h,48h,72h,96h,120h,144h后,CCK-8細胞增殖檢測各組細胞增殖活性。結果顯示:腺病毒空載對照組與未轉染組比較,HS776T細胞增殖率無明顯改變(P>0.05),表明腺病毒空載體轉染對HS776T細胞的增殖活性無影響;與腺病毒空載對照組相比,轉染

14、PCDH10組的細胞增殖率逐漸下降,表明PCDH10對HS766T細胞增殖起抑制作用,并呈時間依賴性,轉染96h增殖率下降12.73％(P<0.05);轉染120h增殖率下降19.87%(P<0.01);轉染144h增殖率最低,抑制最強,下降30.14%(P=0.000)。
　　3.2PCDH10轉染對HS776T細胞周期的影響
　　轉染PCDH10基因72h,流式細胞儀DNA含量分析法檢測各組細胞周期。結果顯示:與未感染組

15、和腺病毒空載組比較,PCDH10組細胞增殖期(S、G2/M期)細胞和靜止期(G0、G1期)各細胞周期比例均無明顯變化(P>0.05),表明PCDH10對HS776T的細胞周期沒有影響。
　　3.3PCDH10轉染對HS776T細胞遷移能力的影響
　　轉染PCDH10基因24h,48h后,采用細胞劃痕實驗測定細胞遷移能力。結果顯示:與未感染組比較,腺病毒空載組24h和48h細胞的遷移率無明顯差異(P>0.05),表明腺病毒空載

16、轉染對HS776T細胞的遷移活性無影響;而轉染PCDH10基因組劃痕處的HS776T細胞的遷移明顯受抑制,24h和48h細胞的遷移率較腺病毒空載對照組明顯下降(P<0.01),分別下降30.07%和52.95%(P=0.000),表明PCDH10能明顯抑制HS776T細胞的遷移能力。
　　3.4PCDH10轉染對HS776T細胞侵襲能力的影響
　　轉染PCDH10基因24h,采用Transwell實驗測定細胞侵襲能力。結果顯

17、示:與未感染組比較,腺病毒空載組細胞24h穿過Matrigel膠及Transwell膜的細胞數(shù)無明顯差異(P>0.05),表明腺病毒空載體轉染對HS776T細胞的侵襲活性無影響;而轉染PCDH10基因組與腺病毒空載組相比,HS776T細胞侵襲重建基底膜能力受到顯著的抑制,穿過Matrigel膠及Transwell膜的細胞數(shù)明顯減少(P<0.01),侵襲活性下降58.56%(P=0.000),表明PCDH10能明顯抑制HS776T細胞侵襲

18、能力。
　　結論:
　　綜上所述,本課題首次從正常人睪丸組織中成功篩選和鑒定出新的hTERT相互作用蛋白PCDH10,并在體內(nèi)驗證hTERT和PCDH10間存在相互作用;其次通過在端粒酶強陽性的腫瘤細胞中過表達PCDH10,體外實驗初步闡明PCDH10對hTERT表達無影響,而它與hTERT相互作用抑制端粒酶活性;最后明確PCDH10在體外具有抑制腫瘤細胞生長,降低腫瘤細胞遷移和侵襲等細胞生物學效應;同時推測外源性過表達PC