果蠅中與Trio相互作用的microRNAs的篩選及鑒定.pdf

1、神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)與分化的調(diào)控機(jī)制是非常復(fù)雜的，其中也可能包括許多 microRNA (miRNA)的參與。miRNA是一類(lèi)新近發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA，通常長(zhǎng)度約為19～25nt，能夠通過(guò)與靶mRNA特異性堿基配對(duì)引起靶mRNA的降解或者翻譯的抑制，從而對(duì)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)調(diào)控。本文主要利用反向遺傳學(xué)的方法篩選果蠅中與軸突導(dǎo)向相關(guān)因子Trio相互作用的miRNAs，希望以靶基因Trio為切入點(diǎn)，了解miRNA對(duì)靶基因的調(diào)控機(jī)制，探討miRNA在

2、軸突導(dǎo)向等神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中的生物學(xué)功能。 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)果蠅中有多種可能與靶基因Trio相互作用miRNA，其中miR-184有三個(gè)可能與Trio結(jié)合的位點(diǎn)，相對(duì)與其作用可能性較大。分析發(fā)現(xiàn)miR-184在果蠅、小鼠、人中高度保守，在果蠅D.melanogaster胚胎、幼蟲(chóng)、成蟲(chóng)中表達(dá)水平逐漸升高。凝膠電泳遷移率分析 (EMSA)顯示miR-184與Trio 3`UTR能在體外特異性地結(jié)合，但果蠅S2細(xì)胞內(nèi)分析的結(jié)果顯示，兩者沒(méi)

3、有明顯的相互作用。 miRNA對(duì)靶基因的調(diào)控既是一對(duì)多的關(guān)系，又是多對(duì)一的關(guān)系。除了miR-184外，miR-310\1\2\3基因簇、miR-317、miR-282等許多miRNAs都可能作用于Trio。為了分析這些miRNAs與Trio的相互作用，我們構(gòu)建了果蠅S2細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)這些miRNAs、及Trio 3`UTR和報(bào)告基因熒光素酶融合表達(dá)的重組質(zhì)粒，通過(guò)這幾種miRNAs的過(guò)表達(dá)對(duì)熒光素酶活性的影響分析兩者的相互作用。結(jié)

4、果顯示，miR-310\1\2\3基因簇、miR-92a、miR-92b能夠下調(diào)與Trio 3`UTR融合表達(dá)的熒光素酶的活性。另外，我們還誘導(dǎo)表達(dá)了Trio蛋白，制備了抗Trio的多克隆抗體，通過(guò)這幾種miRNAs的過(guò)表達(dá)對(duì)S2細(xì)胞內(nèi)源性Trio蛋自表達(dá)的影響進(jìn)一步確定兩者的相互作用。Western blot結(jié)果與報(bào)道基因分析的結(jié)果基本一致，miR-310\1\2\3基因簇、miR-92a、miR-92b的過(guò)表達(dá)均能下調(diào)內(nèi)源性Trio

5、蛋白的表達(dá)水平。 果蠅胚胎整體原位雜交的結(jié)果顯示，miR-92a、miR-92b與Trio3`UTR都在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)，體內(nèi)存在共定位并相互作用的可能，因沒(méi)有檢測(cè)到miR-310\1\2\3基因簇的表達(dá)條帶，所以選擇miR-92a、miR-92b進(jìn)行進(jìn)一步的分析。我們把Trio 3`UTR中可能與miR-92a、miR-92b作用位點(diǎn)突變后分析結(jié)果顯示，能夠分別減少這兩利miRNA對(duì)報(bào)告基因熒光素酶活性的影響。RT-PCR分析

6、結(jié)果顯示，miR-92a、miR-92b不影響Trio的mRNA水平。即和大多數(shù)動(dòng)物中miRNA作用于靶基因的作用方式一樣，在果蠅S2細(xì)胞內(nèi)miR-92a、miR-92b通過(guò)作用于Trio 3`UTR的預(yù)測(cè)位點(diǎn)，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控Trio的表達(dá)。 最后，本文還巧妙利用GAL4能夠結(jié)合并激活UAS控制下基因轉(zhuǎn)錄的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了一種細(xì)胞水平分析miRNA與靶基因相互作用的研究方法。這種方法能夠克服傳統(tǒng)方法中因miRNA對(duì)靶基因微調(diào)而造成