法氏囊活性肽BP5腫瘤細(xì)胞相互作用蛋白的篩選及鑒定.pdf

1、法氏囊（bursa of Fabricus, BF）是禽類特有的體液中樞免疫器官，負(fù)責(zé)B細(xì)胞的發(fā)育和抗體的分泌。法氏囊活性肽 BP5（Bursopentin）是從雞 BF中分離到的一種新的免疫活性肽，不僅能夠調(diào)節(jié)體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，還具有抗氧化和抗腫瘤活性。目前，BP5抗腫瘤的作用機(jī)制尚不清楚。本研究旨在利用噬菌體展示技術(shù)，結(jié)合 BP5誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)譜分析及生物信息學(xué)分析，以期篩選出 BP5腫瘤細(xì)胞相互作用蛋白并對(duì)其進(jìn)行初步

2、鑒定，同時(shí)初步揭示 BP5抗腫瘤作用機(jī)制。本研究主要包括以下三個(gè)方面的內(nèi)容：
　　1、法氏囊BP5特異性結(jié)合肽的篩選及鑒定
　　利用噬菌體展示技術(shù)，以BP5-BSA為靶分子對(duì)噬菌體隨機(jī)12肽庫進(jìn)行4輪親和篩選，結(jié)合 ELISA鑒定和競爭抑制試驗(yàn)，篩選出3個(gè)BP5特異性結(jié)合肽，分別為：PINMQTLNCMAA（ P2-12）、GCTLNPMSDLLG（ P6-12）和MSSTLNGMLNSL（P7-12），其核心基序?yàn)?TLN

3、XM。采用 MTT法檢測(cè)其對(duì)BP5抗腫瘤細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果顯示，P2-12和 P7-12肽在0.2-20μg/mL下，P6-12在2-20μg/mL濃度下均能抑制 BP5抗小鼠 WEHI-231細(xì)胞增殖作用，其中P2-12在2-20μg/mL濃度下抑制作用最顯著（p<0.01）。此外，p53熒光素酶檢測(cè)活性結(jié)果顯示，3種 BP5結(jié)合肽在實(shí)驗(yàn)濃度下均能下調(diào) BP5促 p53基因轉(zhuǎn)錄活性。表明這3種 BP5特異性結(jié)合肽均能下調(diào) BP5

4、的抗腫瘤活性。為研究BP5的抗腫瘤作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　2、雞DT40細(xì)胞cDNA T7噬菌體文庫的構(gòu)建及BP5雞DT40細(xì)胞相互作用蛋白的篩選
　　以雞 DT40細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞模型，利用 T7噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建雞 DT40細(xì)胞cDNA T7噬菌體文庫，并以BP5-BSA為靶分子對(duì)文庫進(jìn)行親和篩選，結(jié)合序列測(cè)定和生物信息學(xué)分析，篩選 BP5雞 DT40細(xì)胞相互作用蛋白。結(jié)果顯示，構(gòu)建的雞DT40細(xì)胞cDNA T7噬菌體文

5、庫原始滴度為1.2×104pfu/mL，擴(kuò)增后滴度達(dá)1.9×109 pfu/mL，文庫重組率為91.7％，且插入片段大多在250-1000 bp。隨機(jī)選取12個(gè)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示插入序列均為雞源序列。通過三輪親和淘選，結(jié)合序列測(cè)定獲得3條與 BP5結(jié)合的雞源蛋白運(yùn)輸?shù)鞍最w粒復(fù)合體2（TRAPPC2，trafficking protein particle complex2）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA，vascular e

6、ndothelial growth factor A）和細(xì)胞周期蛋白E1（CCNE1，cyclin E1）。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)雞的TRAPPC2與小鼠和人的TRAPPC2的同源相似性分別為97.9%、100%，雞的 VEGFA與小鼠和人的VEGFA的同源相似性分別為76.8%、74.1%，雞的CCNE1與小鼠和人的CCNE1的同源相似性分別為67.3%、71.3%，其中，VEGFA是血管生成的重要調(diào)控因子，CCNE1是調(diào)控細(xì)胞周期G1/

7、S期的重要的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，二者的異常表達(dá)均與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，提示 BP5的抗腫瘤作用可能與 VEGFA和CCNE1相關(guān)，為進(jìn)一步研究BP5腫瘤細(xì)胞相互作用蛋白提供科學(xué)依據(jù)。
　　3、BP5刺激的雞DT40細(xì)胞基因表達(dá)譜分析
　　以 BP5刺激雞 DT40細(xì)胞，通過基因芯片技術(shù)來分析 BP5刺激后雞 DT40細(xì)胞中基因表達(dá)譜的變化情況。結(jié)果顯示，BP5參與調(diào)節(jié)多條與抗腫瘤功能有關(guān)的通路，其中包括p53信號(hào)通路，且

8、p53信號(hào)通路涉及的5個(gè)差異表達(dá)基因均與細(xì)胞周期調(diào)控或抗腫瘤相關(guān)，其中SIAH1、TP53(p53)、CIP1(p21)基因被上調(diào)，CHEK2、CCNE1基因被下調(diào)。BP5依賴 p53腫瘤信號(hào)通路分析結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)錄水平上，BP5在0.2-20μg/mL濃度下能夠明顯提高HCT116細(xì)胞中p53相對(duì) Luciferase活性，在蛋白表達(dá)水平上，BP5能顯著促進(jìn) p53、p21蛋白的表達(dá)水平，顯著降低CCNE1和CHEK2蛋白的表達(dá)水平。