A型核纖層蛋白前體相互作用蛋白的篩選、鑒定及其功能的初步研究.pdf

1、廣東醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文A型核纖層蛋白前體相互作用蛋白的篩選、鑒定及其功能的初步研究姓名：劉振杰申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：劉新光;梁念慈20080501A 型核纖層蛋白前體相互作用蛋白的篩選、鑒定及其功能的初步研究中文摘要目的與背景：隨著老年社會(huì)的到來(lái)，有關(guān)衰老的研究就非常必要。兒童早老癥( H u t c h i n s o n - G i l f o r d P r o g e r i aS y n d r

2、 o m e ，H G P S ) 是一種非常罕見(jiàn)的遺傳疾病。H G P S 的病因是由于A 型核纖層蛋白前體( p r e l a m i nA ) 力f l T 異常，產(chǎn)生截短5 0 個(gè)氨基酸的蛋白所致；而p r e l a m i n A 加工所需的金屬蛋白酶Z m p s t e 2 4 缺失導(dǎo)致p r e l a m i nA 不能被正常加工，出現(xiàn)大量堆積，同樣表現(xiàn)出典型早衰的現(xiàn)象?？梢?jiàn)p r e l a m i n A的加工

3、過(guò)程與衰老密切相關(guān)，這個(gè)過(guò)程很可能通過(guò)p r e l a m i nA 相互作用蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)。本研究采用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選p r e l a m i n A 相互作用蛋白，并對(duì)部分蛋白的功能進(jìn)行了初步的研究。方法：將預(yù)轉(zhuǎn)人骨骼肌細(xì)胞e D N A 文庫(kù)酵母菌Y 1 8 7 ( 含A D 質(zhì)粒) 與無(wú)自主激活的酵母菌A H l 0 9 ( 含B D 質(zhì)粒) 雜交融合后得到初篩候選陽(yáng)性克隆；提取質(zhì)粒并電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌J M l 0 9 獲得單

4、一文庫(kù)質(zhì)粒再進(jìn)行自主激活報(bào)告基因檢測(cè)和一對(duì)一回復(fù)性雜交實(shí)驗(yàn)，最后篩選出真陽(yáng)性克隆( 即與人p r e l a m i nA 相互作用的蛋白) 。經(jīng)上述一對(duì)一回復(fù)確證為陽(yáng)性相互作用的A D 質(zhì)粒，以p A C T 2 質(zhì)粒的通用引物為測(cè)序引物測(cè)定該質(zhì)粒的插入片段e D N A 序列。并通過(guò)N C B I 進(jìn)行B L A S T 分析，最終確定這些相互作用蛋白的名稱。將確定的蛋白的A D 質(zhì)粒與B D 質(zhì)粒p G B K T 7 ．L A

5、．C ，p G B K T 7 一P L A 和p G B K T 7 ．L A 再次進(jìn)行一對(duì)一回復(fù)性雜交，確定這些相互作用蛋白與p r e l a m i nA 全長(zhǎng)以及l(fā) a m i nA 蛋白的相互作用情況。用G S Tp u l l ．d o w n 在細(xì)胞外進(jìn)一步證實(shí)蛋白質(zhì)問(wèn)的相互作用，并運(yùn)用R T ．P C R 及熒光蛋白融合表達(dá)了解該蛋白在人胚腎細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。結(jié)果：以p r e l a m i n A 的C 末端為誘餌

6、蛋白篩選出2 1 個(gè)陽(yáng)性相互作用的蛋白。序列比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中l(wèi) 8 個(gè)為己知蛋白，3 個(gè)為未知新蛋白。與全長(zhǎng)p r e l a m i nA 和l a m i nA 蛋白一對(duì)一回復(fù)性雜交發(fā)現(xiàn)其中2 0 個(gè)蛋白與兩者均能結(jié)合，僅有N a r f 不與l a m i nA 蛋白相互作用，為p r e l a m i n A 特異結(jié)合蛋白。G S T p u l l ．d o w n 結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了人金屬硫蛋白M T ．2 A 與人l a