用酵母雙雜交系統(tǒng)從人骨骼肌cDNA文庫(kù)中篩選與A型核纖層蛋白相互作用蛋白的研究.pdf

1、背景與目的：核纖層是在真核細(xì)胞中普遍存在的結(jié)構(gòu)，位于核被膜之下、與細(xì)胞核內(nèi)膜緊密結(jié)合的—層電子密度高的纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。核纖層蛋白可分為A型和B型兩種，分別由A型核纖層蛋白基因(LMNA)和B型核纖層蛋白基因(LMNB)編碼，與中等纖維蛋白家族具有高度同源性，可能在維持核膜完整性、提供染色體錨著位點(diǎn)以及在核周期性的解體和重組裝過(guò)程中發(fā)揮重要作用。A型核纖層蛋白(lamin A)基因突變或其加工酶 Zmpste24活性喪失可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)prel

2、amin A 堆積，從而引起多種疾病的產(chǎn)生，包括多種肌營(yíng)養(yǎng)不良癥和心肌病綜合癥等，統(tǒng)稱(chēng)為核纖層蛋白病。為研究lamin A在肌營(yíng)養(yǎng)不良癥中的發(fā)生機(jī)制，本研究擬采用酵母雙雜交系統(tǒng)從人骨骼肌cDNA文庫(kù)中篩選與lamin A相互作用的蛋白。 方法：擴(kuò)增Lamin A的C末端831bp的片段，構(gòu)建于pGBKT7載體上，即BD質(zhì)粒；將其與構(gòu)建于pACT2質(zhì)粒(酵母雙雜交中的AD質(zhì)粒)的人骨骼肌cDNA文庫(kù)共轉(zhuǎn)染感受態(tài)酵母菌 AH109。

3、用AD質(zhì)粒和BD質(zhì)粒進(jìn)行酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)，以初步篩選出陽(yáng)性候選克隆，再對(duì)上述篩選的陽(yáng)性候選克隆進(jìn)行一對(duì)一回復(fù)性雜交，最后篩選出真陽(yáng)性克隆(即與lamin A相互作用的蛋白)。經(jīng)上述一對(duì)一回復(fù)確證為陽(yáng)性相互作用的AD質(zhì)粒，以pACT2質(zhì)粒的通用引物為測(cè)序引物測(cè)定該質(zhì)粒的插入片段cDNA序列。通過(guò)國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，以美國(guó)國(guó)立生物信息中心(NCBI)的BLAST作為主要的檢索工具，檢索主要程序采用BLASTN，對(duì)相互作用蛋白的cDNA 序列進(jìn)行同源

4、性分析，最終確定該相互作用蛋白的名稱(chēng)。 結(jié)果：經(jīng)過(guò)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn),篩選出9種與lamin A相互作用蛋白，核酸序列分析及同源性檢索結(jié)果為：①插入片段約為768bp，其149～768bp與人心肌ATP酶Ca<'2+>轉(zhuǎn)運(yùn)快速轉(zhuǎn)換體1(ATP2A1)cDNA2 246～2 866bp 有100.0％同源性。②插入片段約為928bp，其146～928與人鈣粘蛋白15的1 533～2 315bp有100.0％同源性。③插入片段約為975

5、bp，其147～975bp與人整聯(lián)蛋白β1的1 161～1 991bp 有 100.0％同源性。④插入片段約為598bp，其61～587bp與人銅代謝(Murr1)域包含1(COMMD1)的27～553bp 有100.0％同源性。⑤插入片段約為787bp，其67～774bp與人似Der-1域家族成員2(DERL2)的5～712bp有100.0％同源性。⑥插入片段約為916bp，其150～515bp與人營(yíng)養(yǎng)不良性肌強(qiáng)直蛋白激酶(DMPK)

6、的1369～1734bp有100.0％同源性。⑦插入片段約為868bp，其140～843bp與人B細(xì)胞淋巴瘤類(lèi)13(促凋亡因子)(BCL2L13)的512～1 215bp有100.0％同源性。⑨插入片段約為954bp，其152～954bp與人熱激蛋白 90kD ATP 酶激活子同源體1(AHSA1)的291～1093bp有100.0％同源性。⑨插入片段約為947bp，其153～946bp與人假設(shè)蛋白FLJ39502(FLJ39502)的