應(yīng)用酵母雙雜交方法篩選與CVB33C蛋白相互作用人心臟細(xì)胞蛋白.pdf

1、目的:
　　篩選出與CVB33C蛋白發(fā)生相互作用的人心臟細(xì)胞蛋白,并對(duì)陽(yáng)性cDNA克隆進(jìn)行分析和鑒定,為進(jìn)一步探討CVB3的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1、構(gòu)建pGBKT7-3C誘餌質(zhì)粒:提取CVB3感染的HeLa細(xì)胞的總mRNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,PCR擴(kuò)增3C基因片段,用EcoR I和BamH I雙酶切后,克隆于載體pGBKT7中,酶切鑒定進(jìn)行DNA測(cè)序驗(yàn)證;
　　2、檢測(cè)誘餌質(zhì)粒pGBKT7-3C在

2、AH109酵母菌中表達(dá)與對(duì)報(bào)告基因的自激活:驗(yàn)證AH109表型,將誘餌質(zhì)粒pGBKT7-3C用乙酸鋰法轉(zhuǎn)化至AH109中,挑取含pGBKT7-3C重組質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆接種選擇性培養(yǎng)平板,進(jìn)行表型的鑒定,PCR驗(yàn)證陽(yáng)性酵母菌,Western Blot方法檢測(cè)融合蛋白表達(dá),最后檢測(cè)DNA-BD-c-Myc-3C融合蛋白對(duì)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄自激活;
　　3、從人心臟cDNA文庫(kù)中篩選與CVB3-3C蛋白有相互作用的陽(yáng)性候選克隆:采用大規(guī)模酵母

3、配合法,將誘餌菌AH109[pGBKT7-3C]和人心臟cDNA文庫(kù)的培養(yǎng)物Y187[pGADT7-cDNA Library]相互配合,配合后接種于 SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板,30℃倒置培養(yǎng)21d,篩選表達(dá)報(bào)告基因HIS3和ADE2的克隆;
　　4、陽(yáng)性克隆的驗(yàn)證和分析:將陽(yáng)性克隆再轉(zhuǎn)種于SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp/X-a-Gal平板,確保陽(yáng)性克隆表型正確(能同時(shí)表達(dá)3種報(bào)告基因:HIS3

4、、ADE2和MEL1);將pGADT7-ADx質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化至大腸桿菌,擴(kuò)增后提取質(zhì)粒送測(cè)序。測(cè)序結(jié)果的同源性分析通過(guò)NCBI網(wǎng)站的BLAST程序比對(duì)完成(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi)。
　　結(jié)果:
　　1、成功構(gòu)建pGBKT7-3C誘餌質(zhì)粒,經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶酶切和測(cè)序序列分析表明3C巳成功插入pGBKT7載體的多克隆位點(diǎn),其基因序列與CVB3m株(GI:323432)

5、3C基因序列完全一致;
　　2、表型鑒定和PCR法均證實(shí)pGBKT7-3C質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入酵母菌,Western blot證實(shí)AHl09能表達(dá)3C蛋白;缺陷型培養(yǎng)基和酶底物X-α-Gal反應(yīng)結(jié)果顯示3C蛋白對(duì)報(bào)告基因無(wú)轉(zhuǎn)錄自激活作用;
　　3、以CVB33C為誘餌蛋白,從人心臟cDNA文庫(kù)中篩選到18個(gè)陽(yáng)性候選克隆;
　　4、18個(gè)陽(yáng)性候選克隆表型均正確(能同時(shí)表達(dá)3種報(bào)告基因:HIS3、ADE2和MEL1);經(jīng)測(cè)序和同源