輻射致癌相關(guān)蛋白質(zhì)篩選及其表達(dá)研究.pdf

1、研究?jī)?nèi)容和方法： 建立輻射致癌細(xì)胞模型：選取SV40病毒轉(zhuǎn)染的永生化的人支氣管上皮細(xì)胞株(BEAS-2B)，利用γ射線分3次進(jìn)行照射誘導(dǎo)癌變，總劑量22Gy。細(xì)胞惡性程度利用裸鼠致瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒定。 篩選輻射致癌差異蛋白表達(dá)譜：利用2-D凝膠電泳技術(shù)對(duì)正常BEAS-2B細(xì)胞和輻射誘導(dǎo)癌變細(xì)胞的總蛋白進(jìn)行電泳分離。ImageMasterPlatinum5.0圖形分析軟件對(duì)凝膠圖譜進(jìn)行分析，篩選出正常細(xì)胞與癌變細(xì)胞間的差異蛋白

2、質(zhì)點(diǎn)。選取部分差異表達(dá)蛋白點(diǎn)，利用MALDI-TOFMS對(duì)蛋白點(diǎn)進(jìn)行肽指紋譜(PMF)鑒定。 部分蛋白在輻射致癌不同階段的表達(dá)變化情況：從正常細(xì)胞與癌變細(xì)胞差異表達(dá)蛋白譜中選取ENO1、GPXl、Dyrk2PrxⅠ作為代表，利用WesternBlot技術(shù)觀察它們?cè)谳椛浼毙云?、輻射致癌早期、輻射致癌中期和輻射致癌晚期蛋白表達(dá)量的變化。利用熒光定量PCR技術(shù)觀察4種蛋白在輻射急性期、輻射致癌早期、中期和晚期mRNA拷貝數(shù)的變化情況，

3、結(jié)合WersternBlot的結(jié)果，對(duì)這4種蛋白在輻射致癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用進(jìn)行推測(cè)和討論。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：裸鼠致瘤實(shí)驗(yàn)是判斷細(xì)胞是否發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的最終判斷標(biāo)準(zhǔn)。分別取處于對(duì)數(shù)增殖期的BR22P35、BR22P45、BR22P50、BR22P60及正常對(duì)照組細(xì)胞注入到裸鼠頸背部皮膚，細(xì)胞注射量為1×107個(gè)，結(jié)果種植BR22P35和BR22P45細(xì)胞的裸鼠直到自然死亡也未觀察到腫瘤的形成(分別為6只、8只)。而在種植BR22P5

4、0細(xì)胞的8只裸鼠中，經(jīng)過50天的潛伏期后觀察到1只裸鼠的頸背部形成腫瘤。種植BR22P60細(xì)胞的8只裸鼠中，有4只裸鼠在注射1-2個(gè)月后觀察到腫瘤出現(xiàn)，其中1只裸鼠在腫瘤形成4周左右死亡。四只成瘤裸鼠的瘤體緩慢長(zhǎng)大，表現(xiàn)了惡性表形的發(fā)展特點(diǎn)。經(jīng)病理切片證實(shí)為中度惡性支氣管鱗狀上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)移癌。證明該細(xì)胞株已發(fā)生癌變，可作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞模型使用。 雙向凝膠電泳分析正常BEAS-2B細(xì)胞和誘導(dǎo)癌變BEAS-2B細(xì)胞差異表達(dá)蛋白，正常組

5、細(xì)胞凝膠共得到1102±29個(gè)蛋白點(diǎn)，誘導(dǎo)癌變組細(xì)胞共得到1058±33個(gè)蛋白點(diǎn)，電泳結(jié)果重復(fù)性良好，所有凝膠圖譜的蛋白質(zhì)點(diǎn)分布模式非常相似。癌變組與正常組比較，共得到877個(gè)匹配蛋白點(diǎn)，癌變組與正常組的點(diǎn)匹配率分別為79.58％和82.89％。 熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：(1)ENO1的mRNA拷貝數(shù)在輻射癌變組、輻射癌變中期、輻射癌變?cè)缙?、輻射急性期和正常組細(xì)胞中逐漸下降，除去正常細(xì)胞和輻射急性期細(xì)胞間及輻射急性期細(xì)胞和輻射癌

6、變?cè)缙诩?xì)胞間無明顯差異(P＞0.05)外，其余各組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)；其中輻射癌變組細(xì)胞與除輻射癌變中期組細(xì)胞外的各組細(xì)胞間差異明顯(P＜0.01)。(2)PrxⅠ的mRNA拷貝數(shù)在輻射癌變組和輻射癌變中期細(xì)胞間無顯著差異(P＞0.05)；輻射急性期細(xì)胞內(nèi)PrxⅠ的mRNA拷貝數(shù)高于正常組細(xì)胞(P＜0.05)；其余各組間差異顯著(P＜0.01)，且隨著輻射劑量的增加和照后時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，其拷貝數(shù)在正常細(xì)胞中最少，輻射癌

7、變組和輻射中癌變期細(xì)胞中拷貝數(shù)最高。(3)Dyrk2的mRNA拷貝數(shù)除輻射癌變組和輻射癌變中期細(xì)胞間無顯著差異外(P＞0.05)，其余各組間均存在顯著差異(P＜0.01)，且隨著輻射劑量的增加和照后時(shí)間的延長(zhǎng)而減少，其拷貝數(shù)在正常細(xì)胞中最多，輻射癌變組和輻射中癌變期細(xì)胞中拷貝數(shù)最少。其中正常細(xì)胞和輻射急性期細(xì)胞內(nèi)的mRNA拷貝數(shù)與輻射癌變各期細(xì)胞之間差異變化較大。(4)GPX1的mRNA拷貝數(shù)在正常組、輻射急性期、輻射癌變?cè)缙?、輻射癌?/p>

8、中期和輻射癌變組細(xì)胞中逐漸降低，除去輻射癌變組細(xì)胞與癌變中期細(xì)胞間無明顯差異(P＞0.05)外，其余各組之間存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。 討論：ENO1是參與糖酵解過程的一種催化酶，其主要催化2-磷酸甘油酸向磷酸烯醇丙酮酸的轉(zhuǎn)化。近期對(duì)ENO1在腫瘤中作用的研究結(jié)果比較矛盾，有研究表明ENO1及其同基因表達(dá)產(chǎn)物MBP-1可以負(fù)向調(diào)控c-myc的表達(dá)，對(duì)腫瘤的發(fā)生有抑制作用，外源性引入ENO1序列可引起成神經(jīng)細(xì)胞瘤發(fā)生凋亡

9、。在部分腫瘤中ENO1的表達(dá)降低，與其腫瘤抑制功能的預(yù)測(cè)相符。但又有部分研究結(jié)果與其相反，RaczA等研究發(fā)現(xiàn)在人鱗狀上皮細(xì)胞肺癌中ENO1基因擴(kuò)增明顯增高，ZhangD等觀察發(fā)現(xiàn)ENO1蛋白的表達(dá)量在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)升高。本課題實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，無論是在蛋白水平還是在mRNA水平，輻射癌變細(xì)胞中的ENO1表達(dá)量均明顯升高，與RaczA等的觀察結(jié)果相同。同時(shí)本課題的熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)ENO1的mRNA表達(dá)量在輻射急性期和輻射致癌早期時(shí)升高并不顯

10、著，而到輻射致癌中期時(shí)明顯升高，提示ENO1并未參與細(xì)胞的初期轉(zhuǎn)化過程，而細(xì)胞在癌變中期時(shí)已逐步向惡性方向轉(zhuǎn)化，增殖分裂加快，能量消耗增加，引起糖酵解過程逐步加強(qiáng)，這在一定程度上導(dǎo)致ENO1的高表達(dá)。另外輻射誘導(dǎo)癌變的人支氣管上皮細(xì)胞并未因ENO1蛋白的高表達(dá)而發(fā)生凋亡，加之上述研究結(jié)果提示ENO1的腫瘤抑制作用是由于對(duì)c-myc的負(fù)調(diào)控作用而實(shí)現(xiàn)的，因此考慮輻射誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞癌變的過程可能沒有c-myc基因的參與。 Pr

11、xⅠ是一種過氧化物酶，屬于Peroxiredoxin抗氧化蛋白家族。PrxⅠ的抗氧化與自由基清除作用主要通過硫氧還蛋白還原過氧化物或超氧化物，在消除代謝產(chǎn)生的過氧化物中具有重要作用。另外，該蛋白還與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，可以促進(jìn)多種細(xì)胞的增殖與分化。在輻射生物效應(yīng)和癌癥方面，有研究表明PrxⅠ是一個(gè)可誘導(dǎo)的蛋白，在輻射引起的氧化應(yīng)激條件下其表達(dá)顯著增高，并且其表達(dá)水平與輻射的劑量和照射后時(shí)間呈正相關(guān)，另有研究發(fā)現(xiàn)PrxⅠ高表達(dá)于一些惡性腫瘤

12、細(xì)胞中，包括肺癌、乳腺癌、肝癌等，本課題的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上訴研究結(jié)果相符，因此PrxⅠ的升高在一定程度上可能是由于輻射導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)超氧化合物增多，間接引起PrxⅠ的表達(dá)升高。另有研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染外源性的PrxⅠ可增加腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑誘導(dǎo)凋亡作用的抗性，增加腫瘤細(xì)胞的存活率；ChenMF等研究發(fā)現(xiàn)，抑制PrxⅠ在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)導(dǎo)致肺癌細(xì)胞增殖緩慢且對(duì)輻射抗性降低，因此提示PrxⅠ可能在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、發(fā)展以及提高腫瘤細(xì)胞輻射抗性方面方面起重要作

13、用。 Dyrk2是Dyrk蛋白家族)的一個(gè)成員。該蛋白激酶家族對(duì)蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸和酪氨酸片斷均具有磷酸化活性。目前，該蛋白家族的細(xì)胞功能仍不十分清楚。有研究發(fā)現(xiàn)在肺及胃腸道的腺癌細(xì)胞中Dyrk2的蛋白和mRNA表達(dá)量均明顯升高，ParkGH等發(fā)現(xiàn)利用抗癌劑8-Cl-cAMP處理成神經(jīng)瘤細(xì)胞后導(dǎo)致Dyrk2的mRNA表達(dá)量下降，提示Dyrk2可能在腫瘤的發(fā)生和增殖中起重要作用。但是本課題的研究發(fā)現(xiàn)在輻射誘導(dǎo)癌變的人支氣管上皮細(xì)

14、胞中Dyrk2的表達(dá)量卻明顯下降，與上述研究的結(jié)果完全相反，經(jīng)檢索也未發(fā)現(xiàn)與本研究相一致的結(jié)果報(bào)告。我們認(rèn)為可能有以下幾種原因：首先，上述幾項(xiàng)研究主要在腺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Dyrk2的表達(dá)升高，而本課題觀察的是鱗狀上皮細(xì)胞癌，Dyrk2是否存在組織表達(dá)特異性的可能目前尚不清楚。其次，上述研究并未引入輻射處理因素，Dyrk2的表達(dá)降低可能為輻射因素誘導(dǎo)的結(jié)果，但目前尚無相關(guān)文獻(xiàn)支持，有待于進(jìn)一步證實(shí)。再次，輻射效應(yīng)和腫瘤的發(fā)生過程是一個(gè)多基因參

15、與的復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控過程，有諸多的細(xì)胞信號(hào)通路與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，本課題中輻射誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞癌變的過程可能并沒有Dyrk2所介導(dǎo)的信號(hào)通路參與，而同時(shí)由于細(xì)胞信號(hào)的網(wǎng)絡(luò)化調(diào)控，細(xì)胞在癌變過程中對(duì)其余信號(hào)通路產(chǎn)生了負(fù)向調(diào)控作用，間接導(dǎo)致Dyrk2的表達(dá)量下降?？傊?，由于癌癥發(fā)生及發(fā)展過程的高度復(fù)雜性，我們無法對(duì)很多基因的表達(dá)情況作出準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)，對(duì)矛盾結(jié)果的深入研究可能更加有助于我們對(duì)癌癥發(fā)生機(jī)理的理解。 GPX1是一種含硒抗

16、氧化物酶，在細(xì)胞中的主要作用是通過還原性谷胱甘肽催化還原過氧化物和有機(jī)過氧化氫物，從而保護(hù)細(xì)胞和其它如DNA，蛋白及脂質(zhì)體等敏感生物分子免受氧自由基的損傷。近期研究發(fā)現(xiàn)硒元素可以降低很多腫瘤的發(fā)生率，有臨床觀察發(fā)現(xiàn)體內(nèi)硒元素的水平與結(jié)腸癌的發(fā)病率呈顯著負(fù)相關(guān)，臨床補(bǔ)充硒元素可降低結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率。 通過本課題，我們成功建立了輻射致癌的細(xì)胞模型，利用二維凝膠電泳和生物質(zhì)譜技術(shù)得到輻射致癌的蛋白表達(dá)改變譜，并對(duì)其中4個(gè)蛋白(

17、ENO1、PrxⅠ、Dyrk2和GPX1)在輻射致癌不同階段的表達(dá)情況進(jìn)行了分析。經(jīng)過對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，我們認(rèn)為：ENO1可能并未參與細(xì)胞的初期轉(zhuǎn)化過程，其升高可能是由于細(xì)胞惡變過程中糖酵解加強(qiáng)所引起；PrxⅠ可能在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、發(fā)展以及提高腫瘤細(xì)胞輻射抗性方面起重要作用；Dyrk2的結(jié)果與其它研究者的結(jié)果截然相反，我們考慮Dyrk2可能存在組織表達(dá)特異性或者其表達(dá)降低是由輻射因素所引起；GPX1的降低可能與輻射誘導(dǎo)癌變的啟動(dòng)密切