蛋白質組學技術篩選新生隱球菌侵襲血管內皮細胞相關蛋白質及其表達研究.pdf

1、本課題擬以新生隱球菌侵襲血管內皮細胞模型為研究對象，采用二維凝膠電泳及生物質譜技術，分析研究血管內皮細胞蛋白質改變譜，選出在這一過程中可能起重要作用的部分蛋白質，同時利用熒光定量PCR技術分析這些蛋白質的mRNA在侵襲過程中不同階段的轉錄情況，尋找在這一過程中起關鍵作用的蛋白質分子。 研究內容和方法： 建立新生隱球菌侵襲血管內皮細胞模型并篩選相應菌株：選取原代培養(yǎng)的人臍靜脈血管內皮細胞(HUVEC)，培養(yǎng)擴增至所需數(shù)量。

2、選取新生隱球菌標準野生株B3501、莢膜缺陷株Cap60和白化株Mel-這3種新生隱球菌，活化培養(yǎng)后制成菌懸液，加入血管內皮細胞培養(yǎng)基中，分別共孵育30min，1h，2h，3h，4h，5h。通過CCK-8法及流式細胞儀對血管內皮細胞孵育不同時段活性的檢測，探索出新生隱球菌與血管內皮細胞孵育的適合時間，并確定以新生隱球菌標準野生株B3501作為下一步實驗中所采用的菌株。 篩選與新生隱球菌孵育后血管內皮細胞的差異蛋白表達譜：利用2-

3、D凝膠電泳技術對正常HUVEC細胞和與新生隱球菌B350l共孵育4小時后的HUVEC總蛋白進行電泳分離，獲得相應蛋白質譜。ImageMaster Platinum5.0圖形分析軟件對凝膠圖譜進行分析，篩選出正常細胞與孵育后細胞間的差異蛋白質點。選取部分差異表達蛋白點，利用MALDI-TOF MS對蛋白點進行肽指紋譜(PMF)鑒定。 部分蛋白在新生隱球菌侵襲血管內皮細胞不同階段的表達變化情況：從正常細胞與癌變細胞差異表達蛋白譜中選

4、取s100A10、Prx Ⅰ作為代表，利用熒光定量PCR技術觀察這兩種蛋白在正常細胞和與新生隱球菌共孵育1、2、4小時后的HUVEC中mRNA拷貝數(shù)的變化情況，對這2種蛋白在新生隱球菌侵襲血管內皮細胞中的作用進行推測和討論。 實驗結果： 不同新生隱球菌菌株對HUVEC的抑制率有著不同程度的影響，這可能與不同菌株的毒力因子發(fā)揮作用的機制不同有關。三種菌株在共孵時間為30min時，三者對HUVEC的抑制率相差不大，分別為40

5、％，41％和40％，統(tǒng)計學上無明顯差異。莢膜缺陷株Cap60對HUVEC的抑制率在1h達到最高峰79％：白化株Mel-對HUVEC的抑制率在3h到最高峰77％。莢膜缺陷株Cap60對HUVEC的抑制率最高，可以達到79％，且達到最高點所需時間最短，在1h達到最高點；白化株Mel-達到最高峰需要的時間略長，在3h時抑制率達到77％，遠遠高于野生株B3501。野生株B3501對HUVEC的抑制率隨時間延長無明顯變化，抑制率變化趨勢比較平穩(wěn)，

6、孵育4小時后，HUVEC沒有出現(xiàn)大量死亡。因此選取野生株B3501作為下一步實驗的菌株，并以孵育4小時作為孵育條件。 雙向凝膠電泳分析正常HUVEC細胞和與新生隱球菌B3501孵育4小時HUVEC細胞總蛋白，孵育組即實驗組凝膠最后共得到921±33個蛋白點，正常細胞組即對照組最后共得到1025±38個蛋白點。3次電泳結果重復性良好，所有凝膠圖譜的蛋白質點分布模式非常相似。實驗組與對照組比較，共得到791個匹配蛋白點，實驗組與對照

7、組的點匹配率分別為77.17％和85.88％。 經(jīng)過比對，實驗組凝膠與對照組凝膠共找到可信差異表達蛋白點19個。其中有5個蛋白點僅在對照組細胞中表達，3個蛋白點僅在實驗組細胞中表達，另有10個蛋白點在實驗組細胞中表達降低，1個在實驗組細胞中表達升高。 對所有僅在一組細胞中表達的的蛋白點和部分差異表達的蛋白點利用MALDI-TOF MS技術進行了PMF(肽指紋譜)鑒定，最后共有15個蛋白質點得到了鑒定。在得到鑒定的蛋白質點

8、中，Prohibitin和Heat-shock protein beta-1僅在實驗組中表達，peroxiredoxin 1等蛋白僅在對照組中表達，S100A10在實驗組中表達增加，超氧化物歧化酶等蛋白在實驗組中表達下降。有許多研究表明這些蛋白參與了細胞的代謝、增殖、信號轉導、運動等生理功能。 熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)： (1)S100A10的mRNA拷貝數(shù)在正常細胞組、孵育1小時、2小時、4小時組中逐漸上升，除去正常細胞組和孵育

9、1小時組之間無明顯差異(P>0.05)外，其余各組之間存在統(tǒng)計學差異(P<0.01)。(2)Prx Ⅰ的mRNA拷貝數(shù)在正常細胞組、孵育1小時、2小時、4小時組中逐漸下降，下降速度快，各組之間均存在統(tǒng)計學差異(P<0.01)。孵育4小時組中Prx Ⅰ的轉錄幾乎被完全抑制。 討論： 新生隱球菌入侵人體是一個復雜的過程，血管內皮細胞構成的屏障是其入侵機體乃至中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最初的也是最關鍵的一道屏障。因此，了解新生隱球菌和血管

10、內皮細胞的相互作用，對于揭開其感染機制可能具有重要的意義。由于蛋白質是基因的最終產(chǎn)物和最終執(zhí)行者，一切疾病的發(fā)病都和蛋白質數(shù)量和功能的改變有關，因此從蛋白質層面研究兩者的相互作用可能更為直接。二維凝膠電泳具有快速、并行、高通量的特點，具有高靈敏度和高分辨率，可以很好地與質譜分析相匹配，能夠同時對全基因組水平的大量蛋白質進行篩選和研究。在本研究中，建立了新生隱球菌和人臍靜脈血管內皮細胞相互作用的模型，利用二維凝膠電泳對新生隱球菌孵育后的H

11、UVEC總蛋白質與正常HLNEC總蛋白質進行了分離鑒定，初步鑒定出13個差異表達的蛋白點。這些蛋白參與了細胞的代謝、增殖、信號轉導、運動等生理功能，提示這些蛋白表達的改變可能是新生隱球菌影響HIJVEC功能的手段。 縱觀以上蛋白，可以發(fā)現(xiàn)這些蛋白的功能主要集中在三個方面，一是調節(jié)細胞凋亡，二是參與細胞骨架，三是參與細胞代謝。蛋白S100A10(Calpactin Ⅰlight chain)，依鈣蛋白Ⅰ輕鏈，又稱p11蛋白、S10

12、0A10蛋白，屬于鈣結合蛋白家族中的S100蛋白家族。S100蛋白家族分子量在10～12kD，其氨基酸序列高度保守，與其他鈣離子結合蛋白具有高度同源性。S100蛋白的兩個亞基與鈣離子結合后，與靶蛋白結合從而發(fā)揮其生物學效應，其功能與細胞周期進程、細胞凋亡、細胞分化、細胞骨架、細胞遷移等有關，對腫瘤的發(fā)生發(fā)展有重要意義。S100A10蛋白的靶蛋白是S100蛋白家族的另一成員膜聯(lián)蛋白Ⅱ(annexinⅡ、依鈣蛋白Ⅰ重鏈)，兩者形成一緊密的四

13、聚體膜聯(lián)復合物，它們形成的復合物有信號轉導的作用，可對肌動蛋白細胞骨架的活動產(chǎn)生明顯的影響。而肌動蛋白細胞骨架支持著細胞的各項活動如胞吞、胞吐、定向生長、黏附、遷移等。有研究顯示，annexin Ⅱ與巨噬細胞的吞噬功能及細胞分泌功能均有關系。敲除annexinⅡ的表達可減少神經(jīng)膠質瘤細胞的遷移。這些都說明S100A10的表達增高，可能對細胞遷移及胞吐作用、內吞作用具有重要意義。本實驗中，實驗組細胞中S100A10蛋白表達增加，表明HUV

14、EC細胞骨架活動可能增加，細胞的遷移、胞吞、胞吐等活動有可能增強。推測HUVEC出現(xiàn)上述現(xiàn)象對于新生隱球菌穿越血管屏障是有利的，也可能是新生隱球菌通過血管內皮細胞層的機制之一。推測新生隱球菌可能增強HUVEC胞吞、胞吐等活動，先被HUVEC吞噬，然后從內皮細胞的另一側被釋放，從而穿越了血管屏障。 Peroxiredoxin(Prx)是新發(fā)現(xiàn)的一類過氧化物酶，其催化活性和蛋白序列與其他抗氧化劑完全不同，廣泛存在于原核生物和真核生物中。在哺

15、乳動物中，Prx蛋白家族包括6個成員，Prx Ⅰ-Ⅵ，其生化功能是通過硫氧還蛋白利用谷胱甘肽作為還原劑，還原、消除代謝產(chǎn)生過氧化物或超氧化物。Prx Ⅰ定位于細胞質中，是一個可誘導的蛋白，在氧化應激條件下其表達顯著增高。有實驗證實，通過腺病毒介導轉化增加peroxiredoxin基因的表達，可保護細胞膜免受磷脂過氧化物介導的膜損傷，使小鼠肺免于高氧損傷，并使小鼠在高氧條件下的生存時間延長。 以上這些蛋白與Prx Ⅰ、S100A1

16、0相互印證，進一步提示，新生隱球菌和HUVEC作用后可能通過以下幾個方面影響HUVEC的正常生理功能： 一、減少HUVEC對氧應激的耐受能力，細胞損傷增加，增殖能力下降。 二、增強細胞骨架活動能力，促進細胞胞吞胞吐活動。S100A10與靶蛋白形成的復合物可能增強細胞骨架活動，加強胞吞胞吐活動，新生隱球菌可能通過先被吞噬，穿過細胞后被釋放的方式穿越血管內皮細胞屏障。另外Prohibitin增高也可能促進了細胞骨架的活動。

17、 三、促進細胞凋亡。HSP27和PSA7等可能與細胞凋亡過程有關，促進了HUVEC細胞凋亡。 四、影響了HUVEC正常的細胞內信號轉導過程。Prx Ⅰ、S100A10和CacyBP等蛋白都參與了細胞內的信號轉導過程，細胞的正常生理功能也受到了影響。 五、抑制細胞能量代謝。AK4、蘋果酸脫氫酶的表達下降可能使細胞能量代謝受到抑制，細胞ATP水平下降，導致細胞生理活動減弱，細胞功能紊亂。 以上五個方面的作用，使

18、得HUVEC凋亡增加，增殖減少，從而破壞了血管內皮細胞層的完整，進而破壞血管屏障功能的健全，為新生隱球菌穿越血管屏障創(chuàng)造良好的條件。同時發(fā)現(xiàn)，在細胞總體生理功能下降的同時，細胞的細胞骨架活動卻得到了增強，因此推測新生隱球菌能促進HUVEC的細胞骨架功能，加強其吞噬和胞吐能力，可能對新生隱球菌穿越血管內皮細胞屏障是有利的。這也可能是導致新生隱球菌穿越氣血、血腦屏障的機理之一。如能弄清這種機制產(chǎn)生的具體過程，抑制這一過程，可能對新生隱球菌病