擬南芥隱花素蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、隱花素是植物的藍(lán)光受體，在植物中調(diào)節(jié)多種光形態(tài)建成，包括抑制下胚軸的伸長、子葉的伸展和調(diào)節(jié)植物的開花時間等，但隱花素依賴藍(lán)光調(diào)節(jié)光形態(tài)建成的分子機制仍然不清楚。本文以擬南芥隱花素突變體(CRY:cryl-304,crylcry2)和哥侖比亞野生型(col-4)幼苗為材料，采用蛋白質(zhì)雙向電泳分離技術(shù)、MALDI-TOF-TOF、離子阱質(zhì)譜鑒定技術(shù)以及生物信息學(xué)分析等手段，對在不同光處理條件下擬南芥隱花素突變體和野生型幼苗的全蛋白質(zhì)組和核蛋

2、白質(zhì)組進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究，目的是探討擬南芥CRY、col-4光信號應(yīng)答相關(guān)蛋白質(zhì)，及其網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機制。研究結(jié)果如下： (1)提取生長在白光、藍(lán)光和暗處理中的cry1-304、col-4 7天幼苗的全蛋白質(zhì)，雙向電泳分離蛋白質(zhì)，經(jīng)圖像分析軟件分析，在cry1-304和col-4之間找到44個差異蛋白質(zhì)點，質(zhì)譜鑒定到21個蛋白質(zhì)。相對于cry1-304，在白光下有15個蛋白質(zhì)點上調(diào)，6個蛋白質(zhì)點下調(diào)：在藍(lán)光下有17個蛋白質(zhì)點上調(diào)，

3、4個蛋白質(zhì)點下調(diào)；暗處理中有7個蛋白質(zhì)點上調(diào)，3個下調(diào)，9個不變，其余2個蛋白質(zhì)點消失。這些蛋白質(zhì)中有兩個是未知功能的，其余的蛋白質(zhì)有7個參與代謝反應(yīng)并且其中是4個參與能量代謝、3個與抵抗壓力相關(guān)、4個參與轉(zhuǎn)錄、2個與蛋白質(zhì)合成有關(guān)、1個參與RNA合成、1個參與蛋白質(zhì)折疊、1個與細(xì)胞運輸機制的功能相關(guān)。用半定量RT-PCR分析了其中4個蛋白質(zhì)點相對應(yīng)的基因表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有1個蛋白質(zhì)水平的表達(dá)與相同處理下mRNA水平的表達(dá)相一致，另外3個

4、蛋白質(zhì)點的mRNA水平的表達(dá)與蛋白質(zhì)水平的表達(dá)不一致，其原因可能是由于基因表達(dá)存在翻譯后修飾。進(jìn)一步利用Matlab2006的K-means聚類程序的功能對21個差異蛋白質(zhì)的豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，依據(jù)野生型和突變體對光的反應(yīng)可分別形成6類不同反應(yīng)的蛋白表達(dá)方式。本實驗為研究CRY1介導(dǎo)藍(lán)光調(diào)節(jié)基因表達(dá)提供了一個新的研究方法系統(tǒng)，這些分析結(jié)果表明光控制擬南芥的發(fā)育是通過共調(diào)節(jié)許多相關(guān)基因的表達(dá)而實現(xiàn)的。 (2)采用雙向電泳技術(shù)分離

5、cry1cry2和col-4的7天幼苗的全蛋白質(zhì)，經(jīng)圖像軟件分析找到127個差異蛋白質(zhì)點，質(zhì)譜鑒定出75個蛋白質(zhì)點。在暗處理下，cry1cry2和野生型之間有67個蛋白質(zhì)豐度發(fā)生變化，cry1cry2有18個蛋白質(zhì)下調(diào)、49個蛋白質(zhì)點上調(diào)；在藍(lán)光處理下，cry1cry2有44個蛋白質(zhì)點下調(diào)，24個上調(diào)；在紅光處理下，有64個蛋白質(zhì)點的豐度發(fā)生改變，39個下調(diào)和25個上調(diào)；野生型coi-4用藍(lán)光或紅光處理，與暗處理比較，分別有40個和46

6、個蛋白點的豐度具有兩倍以上變化，而cry1cry2則分別有49個和40個蛋白質(zhì)點表達(dá)豐度發(fā)生變化。數(shù)據(jù)庫結(jié)果顯示，這些在不同光處理下差異表達(dá)的蛋白質(zhì)主要是參與碳水化合物代謝、能量代謝、細(xì)胞結(jié)構(gòu)組成、抵抗壓力和抗氧化、蛋白質(zhì)的折疊和細(xì)胞壁的形成等功能而且亞細(xì)胞定位主要是在葉綠體和線粒體。我們的研究鑒定出了5個新的光反應(yīng)蛋白，分別是磷酸丙糖表異構(gòu)酶、甘油醛三磷酸脫氫酶A、果糖二磷酸醛縮酶、蘋果酸脫氫酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶B，這些蛋白質(zhì)在

7、cry1cry2藍(lán)光下的表達(dá)都減低。研究找到了7個與下胚軸生長相關(guān)的蛋白，它們是榭皮酮3-0-甲基轉(zhuǎn)移酶、α木糖苷酶、枯草桿菌蛋白水解酶、甘氨酸脫氫酶、甘氨酸富于蛋白、甘氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶，并初步找到了一些與CRY功能相關(guān)的基因。進(jìn)一步對75個鑒定到的差異蛋白質(zhì)的豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示對不同光處理反應(yīng)蛋白，野生型和雙突變體都分為6類，野生型和雙突變體的總聚類可以分為9類，而野生型和突變體在藍(lán)光和紅光下表達(dá)有差異的蛋白質(zhì)其親緣關(guān)系都

8、較近。通過對突變體和野生型的聚類分析，我們首次論證了蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜可用于研究各種突變體在不同光照條件下光應(yīng)答之間的關(guān)系。 (3)研究發(fā)現(xiàn)除了cry1cry2在藍(lán)光下調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達(dá)外，在紅光下蛋白質(zhì)表達(dá)水平也有明顯的差異。為了進(jìn)一步檢測隱花素是否在藍(lán)光和紅光下都調(diào)節(jié)相關(guān)基因的mRNA的表達(dá)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)豐度的改變，我們用RT-PCR和實時定量PCR檢測了野生型和cry1cry2幼苗生長在暗、紅光和藍(lán)光下的CHS、CAB2、GDH和F

9、NR等4個基因的mRNA的表達(dá)。結(jié)果表明cry1cry2在紅光和藍(lán)光下都影響GDH和FNR的mRNA水平表達(dá)的變化，它們的變化趨勢與蛋白質(zhì)變化趨勢一樣，在野生型的藍(lán)光與暗處理的比較(B/D)或紅光與暗處理的比較(R/D)中都增加而在相同比較下突變體cry1cry2中是降低或沒變化。這些結(jié)果提示，隱花素除了本身特異的藍(lán)光功能外，還具有調(diào)節(jié)紅光受體光敏素從而調(diào)控基因表達(dá)的作用。 (4)用雙向電泳、MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜及離子

10、阱質(zhì)譜鑒定了col-4、cry1-304或cry1cry2核蛋白，發(fā)現(xiàn)3個細(xì)胞定位在細(xì)胞核的蛋白質(zhì)，其中14-3-3類蛋白質(zhì)(GF14)對比野生型在兩種突變體中表達(dá)都是上調(diào)，該蛋白質(zhì)預(yù)測具有蛋白質(zhì)綁定的功能，定位于細(xì)胞核核膜，用熒光定位分析表明該蛋白質(zhì)表達(dá)在細(xì)胞核內(nèi)。這一結(jié)果為將來進(jìn)一步研究CRY在核內(nèi)的功能提供了有用的信息。 本研究進(jìn)一步證實，擬南芥CRY基因介導(dǎo)藍(lán)光可以引起一系列蛋白質(zhì)表達(dá)的改變。我們的結(jié)果還首次發(fā)現(xiàn)了隱花素