內(nèi)源性洋地黃素在血管內(nèi)皮細胞作用機制的比較蛋白質(zhì)組學研究.pdf

1、研究背景 洋地黃藥物作為治療充血性心力衰竭的正性肌力藥物，自William Withering首次報道從植物中提取“洋地黃”用以治療充血性心力衰竭以來，應用于臨床已有200多年歷史，對其作用機制的的現(xiàn)代研究證實該類藥物通過抑制Na<'+>-K<'+>-ATP酶(NKA酶)活性而發(fā)揮正性肌力作用，雖然不足以解釋其治療量與中毒量30﹪的重疊這一嚴重制約了其在臨床廣泛應用的重大難題，但迄今尚無可以替代該類藥物的新型高效低毒的強心藥物。

2、研究者觀察到洋地黃藥物通過與NKA酶暴露在細胞外的結(jié)合位點相結(jié)合發(fā)揮強心作用，由此推測在體內(nèi)也應當有內(nèi)源性配基(Ligand)。 本博士學位論文分為四部分，第一部分建立EDLS對體外培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVEC)的作用模型，觀察EDLS對HUVEC生長與功能的影響，初步研究其作用機制；第二部分建立雙向凝膠電泳(2-DE)圖譜，構(gòu)建對照組和EDLS刺激增殖的HUVEC的蛋白質(zhì)圖譜，比較蛋白質(zhì)變化并尋找差異蛋白質(zhì)：第三部分利

3、用電噴霧一離子阱串聯(lián)質(zhì)譜(Liquid chromatography electrosprayionisation mass spectrometry/mass spectrometry,(LT-ESI-MS/MS)技術(shù)、查詢數(shù)據(jù)庫，鑒定差異蛋白質(zhì)：第四部分選取感興趣的差異蛋白點進行功能驗證，并探討其在哇巴因作用中的機制。實驗設計路線圖如下：本研究主要目的、方法、結(jié)果和結(jié)論概述如下： 研究目的 研究EDLS對HUVEC生

4、長的作用，并采用蛋白質(zhì)組學方法闡述畦巴因在踟VEC作用的表達蛋白質(zhì)譜，確定靶位蛋白分子，為開辟心血管疾病治療的新途徑奠定理論基礎。 研究方法 1 EDLS對血管內(nèi)皮細胞作用的研究體外培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUvEC)，建立EDLS作用mYVEC模型，第2-4代用于實驗。實驗分組：12h、24h、48h三個時間點，每一個時間點又分為對照組、哇巴因組、地高辛組和Etacrynic．Acid組。檢測方法：利用四甲基偶氮唑鹽

5、微量酶反應比色法(MTT法)法觀察不同濃度、不同藥物對HUVEC生長(增殖與凋亡)的影響；臺盼藍染液檢測細胞活性；形態(tài)學觀察藥物對細胞運動、黏附等功能的影響；透射電鏡掃描明確細胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)變化；Caspase-3活性測定；流式細胞儀檢測藥物作用后細胞表達增殖、凋亡與壞死的不同表現(xiàn)；以期闡明EDLS對HUVEC生長的作用，初步探討其作用機制。 2 EDLS刺激血管內(nèi)皮細胞增殖作用的差異蛋白質(zhì)篩選分別選取對照組和哇巴因刺激增殖HUVEC細胞

6、，提取細胞總蛋白，進行蛋白質(zhì)分離：利用雙向凝膠電泳(2-DE)技術(shù)對兩組樣品的蛋白質(zhì)分別進行分離，首先應用等電聚焦電泳(IEF)將蛋白質(zhì)在不同PH的梯度進行分離，然后用SDS-PAGE電泳將蛋白質(zhì)在不同分子量梯度上進行分離；進行凝膠染色(銀染)，用掃描儀獲取蛋白質(zhì)雙向凝膠圖譜；應用：PDQuest軟件進行凝膠圖像分析，尋找兩組樣品的差異表達蛋白點，為進一步深入研究哇巴因作用的靶位蛋白奠定基礎。 3 EDLs作用血管內(nèi)皮細胞的差異

7、表達蛋白鑒定.質(zhì)譜鑒定重復2-DE和質(zhì)譜相容性銀染，進行質(zhì)譜鑒定，本實驗使用Finnigan線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀(LTQ)進行液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜。質(zhì)譜儀配置C-18反相色譜柱，流動相(Mobile phase)A和B分別為0.1﹪溶于超純水及乙腈中的甲酸。所有測定均在正離子方式下進行。當進行LC-ESI-MS/MS分析時，Microspray方式進樣，系統(tǒng)裝備一個C18脫鹽預柱(0.15mm×120mm)。毛細管溫度為170度，毛細管電

8、壓為3000 V。串聯(lián)質(zhì)譜掃描包括一個全掃描(full MS scan)及十個串聯(lián)掃描(MS/MS scans)，搜索使用的數(shù)據(jù)庫為IPI上人的非冗余蛋白庫(IPI.HUMAN.v3.07.fasta)，SEQUEST結(jié)果過濾參數(shù)為：當Charge+1，Xcorr≥1.9；當Charge+2，Xcorr≥2.2；當Charge+3，Xcorr≥3.75；其中DelCN≥0.1。 應用EXPASY蛋白質(zhì)組學工具分析等電點、分子量及

9、總平均親水性，采用GO分類工具，從生物學途徑、細胞組件及分子功能三方面對蛋白質(zhì)表達譜進行功能分析及分類。 4 差異蛋白在EDLS作用HUVEC的表達及功能驗證重復哇巴因作用HIJVEC模型的增殖模型，MTT測定細胞生長，流式細胞術(shù)測細胞周期，caspase-3的活性測定凋亡，形態(tài)學檢測細胞運動、黏附功能改變，提取細胞蛋白，western blot檢測myosin regulation light chain2、profilin-

10、1、heat shock protein 60的表達，并應用profilin-1抗體干預哇巴因培細胞體系，觀察對細胞生長的影響。闡述檢測的差異表達蛋白在EDLS刺激HUVEC增殖中的機制。 研究結(jié)果 1 EDLS對VEC生長的影響EDLS具有促進增殖和抑制生長的雙重作用，其效應與時間和濃度相關。與空白對照組比較，低于20nmol/l哇巴因藥物濃度，培養(yǎng)時間在48小時以內(nèi)為促進生長作用，作用高峰出現(xiàn)在10nmol/l的濃度

11、作用24小時：高于50nmol/l則呈現(xiàn)出抑制細胞生長作用，延長作用時間尤為明顯。地高辛也表現(xiàn)出對細胞生長的雙重作用，在低于50nmol/l的濃度時為刺激細胞生長，高于此濃度則為抑制生長，且其抑制生長作用呈現(xiàn)濃度-時間依賴性。 流式細胞術(shù)和透射電鏡超微結(jié)構(gòu)檢測表明EDLS促進VEC生長的影響為增殖，而其抑制細胞生長的作用在一定濃度范圍內(nèi)為誘發(fā)凋亡，高濃度則為凋亡與壞死并存的混合性死亡。 非固醇類Na-KATP酶抑制劑．E

12、tacrynic Acid無促進細胞增殖作用，表明EDI。S在低于10nmol/l時促進細胞增殖作用與其對Na-KATP酶活性的抑制無關。 2 構(gòu)建了穩(wěn)定可靠的實驗組和對照組2-DE圖譜，篩選EDLS刺激HUVEC增殖的差異表達蛋白點兩組樣品分別進行3次重復的2-DE實驗，獲得6張2DE圖像，分離出的蛋白質(zhì)點數(shù)目對照組為2792±124，哇巴因作用組為2806±153，用PDQuest軟件進行圖像的匹配分析，平均匹配率對照組為8

13、6.5﹪，哇巴因組為87.5﹪，重復性較好。 差異蛋白點分析結(jié)果顯示藥物干預組與正常組蛋白點差異2倍以上的點有39個(p<0.05)，其中增殖組差異4倍以上的點有8個(p<0.01)。在得出的32個差異顯著的蛋白質(zhì)點中，哇巴因作用增高的點有18個，下降點為14個：差異5倍的蛋白點，表達增高者5個，降低3個。 3 質(zhì)譜鑒定分析差異蛋白點LTQ-ESI-TOF/TOF-MS鑒定其中具有顯著差異的蛋白點，網(wǎng)上蛋白質(zhì)庫搜索比對后

14、明確32個蛋白質(zhì)，涉及細胞運動、代謝和信號轉(zhuǎn)導等生物學功能。 4 差異蛋白的功能驗證應用western blot檢測差異蛋白myosin regulation light chain2、profilin-1、heatshock protein 60在哇巴因作用叫VEC中的表達，檢測結(jié)果與2-DE結(jié)果吻合。 進一步的研究表明profilin-1在哇巴因促進增殖VEC中表達增高(p<0.01)，應用profilin-1抗體其

15、增殖作用下降，進一步支持了本實驗篩選得出的哇巴因作用VEC差異蛋白是其發(fā)揮促進VEC增殖的靶位蛋白和/或靶位蛋白，提供了具有潛在巨大價值的哇巴因作用靶分子。 結(jié)論 1 EDLS在不同的濃度與作用時間對HUVEC作用不同，既可以促進增殖，又有誘導凋亡和壞死作用，在本研究中其促細胞增殖作用不依賴于對Na-K ATP酶活性的抑制。 2 EDLS促進mYVEC增殖的差異蛋白涉及細胞骨架、信號轉(zhuǎn)導等功能蛋白，其作用途徑不只

16、傳統(tǒng)意義上Na-K．ATP．酶作用通路一條，而是通過多種機制作用于血管內(nèi)皮細胞，以復雜的機制影響細胞生理病理各個過程，在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。 3本研究通過蛋白質(zhì)組學技術(shù)得到的哇巴因刺激血管內(nèi)皮細胞增殖的靶蛋白之一細胞骨架蛋白profilin-1在哇巴因作用通路中發(fā)揮了重要作用。 4本實驗提供了EDLS在血管內(nèi)皮細胞作用蛋白質(zhì)表達的重要信息，為全面闡述EDLS作用分子機理提供了重要方法和新線索，為尋找新的心