晚期氧化蛋白產(chǎn)物對人血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)作用.pdf

1、背景最近研究發(fā)現(xiàn)AOPP可能與動脈粥樣硬化(AS)的發(fā)生有關(guān).動脈粥樣硬化患者血漿AOPP水平明顯高于正常人:血液透析的CRF病人頸動脈內(nèi)膜厚度與血漿AOPP水平呈正相關(guān);靜脈反復(fù)注射AOPP可加速喂高膽固醇飼料兔動脈粥樣硬化斑塊的形成.上述研究提示AOPP可能參與了AS的形成,但其機(jī)制目前還不清楚.該文旨在研究AOPP對血管內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響及其機(jī)制,以探討AOPP參與AS發(fā)生的可能機(jī)制.方法我們以內(nèi)皮細(xì)胞株HUECV304為靶細(xì)胞,

2、觀察AOPP-BSA對內(nèi)皮細(xì)胞ROS生成和細(xì)胞活性的影響.一、無內(nèi)毒素AOPP-BSA的制備:AOPP-BSA的制備采用Witko-Sarsat等介紹的方法.將無內(nèi)毒素BSA溶液與次氯酸(HOCl)分別以1/70和1/140的摩爾比混合,室溫放置30min,制備出兩種氧化修飾程度不同的AOPP-BSA(1/70、1/140).制備的AOPP-BSA在4℃無菌PBS中透析以除去游離次氯酸.AOPP含量測定:以氯胺T為標(biāo)準(zhǔn)曲線,測定酸性條件

3、下340nm的吸光度值.制備的所有AOPP-BSA經(jīng)鱟試驗(yàn)法測定內(nèi)毒素.二、細(xì)胞內(nèi)要ROS生成量的測定1、定性觀察:將細(xì)胞接種于鋪有蓋玻片的24孔板并用對ROS敏感的熒光探針2,7-二氫二氯熒光素(DCFH)標(biāo)記,分別與兩種氧化修飾程度的AOPP-BSA(1/70、1/140)孵育,同時設(shè)PBS和BSA細(xì)胞對照,1h后固定細(xì)胞,在熒光顯微鏡下觀察照像.2、定量測定:用DCFH標(biāo)記細(xì)胞,將標(biāo)記細(xì)胞以2×105/孔加入96孔板,與不同濃度和

4、不同氧化修飾程度的AOPP-BSA作用不同時間,用VICTORWallac 1420多標(biāo)記分析系統(tǒng)(美國PE公司)在激發(fā)光485±10nm、發(fā)射光535±10nm,37℃條件下動態(tài)測定細(xì)胞內(nèi)氧化DCFH產(chǎn)生的熒光量的變化,以此反映ROS的產(chǎn)生量.3、抗氧化劑對AOPP-BSA作用的影響:抗氧化劑PDTC(20 μmol/L)、硒谷胱甘肽過氧化物酶小分子模擬物ebselen(1μmol/L、5μmol/L)、NADPH氧化酶抑制劑apoc

5、ynin(500μmol/L)及NOS抑制劑Nw-Nitro-L-Arginine(L-NNA,5μmol/L)預(yù)孵育1h,DCFH標(biāo)記細(xì)胞,然后用BSA/HOCl摩爾比為1/140的AOPP-BSA(400μg/ml)刺激細(xì)胞1h,測定細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生量,觀察其對AOPP-BSA誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生的影響.三、AOPP對內(nèi)皮細(xì)胞活性影響的測定1、AOPP對內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響的測定:將細(xì)胞按1×104/孔接種于96孔板,貼壁后在無血清培養(yǎng)基

6、中繼續(xù)培養(yǎng)12 h以達(dá)到同步,與不同濃度或不同氧化修飾程度的AOPP-BSA共同培養(yǎng)24 h,用MTT法測定細(xì)胞活性,以PBS代替AOPP作為刺激劑培養(yǎng)的對照細(xì)胞活性為100％,計算AOPP-BSA作用下細(xì)胞活性的百分率.2、抗氧化劑對AOPP-BSA作用的影響:將細(xì)胞與ebselen預(yù)孵育1h,然后再用AOPP-BSA(1/140、800μg/ml)刺激24h,用MTT法測定細(xì)胞活性,觀察ebselen對細(xì)胞活性降低的影響.四、統(tǒng)計方