生存素(Survivin)過表達對血管內皮細胞生物學活性及血管生成能力的影響.pdf

1、外周動脈疾病（periphery artery disease, PAD)包括一系列由供應腦部、內臟器官和肢體的動脈結構和功能改變而導致的非冠狀動脈系統(tǒng)綜合征，即指除冠狀動脈之外的主動脈及其分支動脈的狹窄、閉塞或瘤樣擴增疾病，以下肢動脈硬化閉塞最為常見。目前手術和藥物均無法逆轉動脈壁本身的病變。治療 PAD的關鍵為血管內皮細胞（vascula Endothelial Cells, VECs），其激活、增殖、遷移、管腔結構的形成以及塑形，

2、以出芽的方式形成新的血管并重建形成新生血管網，可增加末梢循環(huán)血量或改善微循環(huán)血液灌注，同時可解決外科血管重建術后動脈長期通暢率的問題。然而，成熟的 VECs的活性低，生長速度及自我更新速度慢。VECs降解細胞外基質和遷移能力弱，導致側枝循環(huán)建立不良，綜上獲得一種耐凋亡、促增殖，同時具備強大的遷移能力和降解細胞外基質的理想VECs是治療PAD的關鍵所在。
　　存活素（survivin，SVV）由142個氨基酸組成，為IAP（inhi

3、bitor of apoptosis protein)家族中分子量最小的成員,在腫瘤細胞中其強大的調節(jié)細胞增殖和抗凋亡能力得到了大量研究證實。SVV是目前已知最強的凋亡抑制因子[1]，可通過抑制Caspase-3,Caspase-9,Caspase-10等凋亡通路中的多個環(huán)節(jié)來抑制細胞的凋亡，同時參與不同細胞周期的調控，并與多種周期調節(jié)蛋白結合，直接調節(jié)細胞的有絲分裂，包括CyclinD,CyclinE等，近年來已有很多研究證實SVV也

4、表達于非腫瘤細胞，如胃粘膜[2]、巨噬細胞[3]以及腎小管上皮細胞等[4]，且SVV并非腫瘤的特異基因，表達后細胞不會產生腫瘤樣轉化。
　　因此本研究培養(yǎng)大鼠動脈內皮細胞，上調其 Survivin基因的表達，以獲得抗凋亡，促增殖的理想血管內皮細胞，并從整體水平探討Survivin基因促進VECs增殖及抗凋亡的機制以及對體內血管生成的影響，為PAD的治療提供一定的理論及實驗基礎。
　　第一部分 Survivin在大鼠血管內皮細

5、胞的表達
　　目的：探討Survivin在大鼠血管內皮細胞中的表達
　　方法：采用真核細胞裂解將正常長至90％左右的大鼠血管內皮細胞裂解，并按照說明提取相應蛋白質，通過western-blot方法檢測正常大鼠血管內皮細胞中Survivin表達狀況。
　　結果：在正常培養(yǎng)的原代大鼠血管內皮細胞中，Survivin表達率高達100%，western-blot結果顯示，在幾組正常的 RAEC中，條帶顯色較弱，灰度均值達13.

6、48。
　　結論：在正常大鼠血管內皮細胞中Survivin均有較低的表達。
　　第二部分攜帶針對大鼠Survivin基因的腺病毒的轉染及對血管內皮細胞生物特性的影響及其機制的研究
　　目的：研究 Survivin基因對大鼠血管內皮細胞增殖、凋亡、周期以及血管生成的影響。
　　方法:擴增、純化過表達大鼠Survivin基因重組腺病毒，利用RT-qPCR、Western-blot檢測對大鼠血管內皮細胞的感染及基因過表

7、達效果。針對過表達 Survivin基因后的大鼠血管內皮細胞，采用流式細胞儀、CCK-8等，檢測 Survivin基因在體外對細胞凋亡、增殖、周期的影響。采用Western-blot檢測在凋亡和周期通路中與Survivin相互作用的凋亡蛋白Caspase-3、bcl-2和周期蛋白CyclinD。將過表達SVV的RAEC采用肌肉注射的方法種植于裸鼠體內，采用免疫組織化學技術對CD31表達陽性的大鼠血管內皮細胞進行檢查。
　　結果：增

8、殖型腺病毒在MOI為300時，轉染率為95%，并具有很明顯的基因過表達作用。Survivin過表達后，上調了bcl-2表達、下調了Caspase-3從而失活或抑制了其介導的凋亡通路，凋亡率明顯降低；同時，Survivin促進了CyclinD的表達，說明SVV可能同時參與了大鼠血管內皮細胞周期的調控，通過細胞周期蛋白 CyclinD等使細胞加速從G1期到S期的轉化。細胞移植2周以后，肌肉種植處免疫組織化學結果顯示有明顯的新生血管產生，說明