人肝癌血管內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)蛋白的篩選及初步分析.pdf

1、本研究采用中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所抗體工程實(shí)驗(yàn)室首創(chuàng)的“功能性抗體庫(kù)篩選腫瘤相關(guān)的功能性基因”的新技術(shù)，重點(diǎn)研究了抗人肝癌血管內(nèi)皮細(xì)胞的單抗，并在體內(nèi)外篩選鑒定了功能性單克隆抗體，初步確定了某些功能性單抗識(shí)別的功能性蛋白的分子量，為分離獲得人肝癌血管內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)的功能性基因奠定了重要的基礎(chǔ)。 研究方法：根據(jù)對(duì)前期的免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫組化研究結(jié)果獲得的119株抗人肝癌血管內(nèi)皮細(xì)胞的單克隆抗體進(jìn)行了體內(nèi)外功能的檢測(cè)、分析和鑒定。首

2、先采用MTT法檢測(cè)了119株單抗對(duì)人肝癌血管內(nèi)皮增殖的作用。采用內(nèi)皮細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)檢測(cè)分析了119株單抗對(duì)人肝癌血管內(nèi)皮細(xì)胞成管功能的影響。在此基礎(chǔ)上選擇在體外明顯抑制人肝癌血管內(nèi)皮增殖的16株單抗在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所抗體工程室建立的“人源化管形成”裸鼠動(dòng)物模型中進(jìn)行體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究。提取人肝癌血管內(nèi)皮細(xì)胞的總蛋白，用體內(nèi)抑瘤效果最好的1株單抗進(jìn)行了DotBlot和WesternBlot分析，初步證明該單抗識(shí)別的功能性蛋白

3、的分子量。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用means+SD表示，SPSS統(tǒng)計(jì)軟件處理，采用方差分析和Student'st檢驗(yàn)方法統(tǒng)計(jì)相關(guān)數(shù)據(jù)。 研究結(jié)果： 1.MTT法檢測(cè)119株單抗對(duì)人肝癌血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用和影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中16株單抗能顯著抑制人肝癌血管內(nèi)皮的增殖，其抑制率達(dá)12-34﹪。其中14株單抗與對(duì)照組相比P值＜0.05具有顯著性差異。 2.內(nèi)皮細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)檢測(cè)分析了119株單抗對(duì)人肝癌血管內(nèi)皮細(xì)胞成管的影響。結(jié)果顯

4、示46株單抗都有不同程度抑制人肝癌血管內(nèi)皮成管功能的作用。其中10株表現(xiàn)為弱抑制作用(+)，18株有中等程度(++)的抑制作用，另有18株表現(xiàn)為顯著的強(qiáng)抑制作用(+++)。而且其中有9株同時(shí)在MTT檢測(cè)中對(duì)人肝癌血管內(nèi)皮的增殖也有明顯抑制作用。 3.采用“人源化血管形成”裸鼠動(dòng)物模型對(duì)MTT篩選出的能抑制人肝癌內(nèi)皮細(xì)胞增殖的16株單抗分批進(jìn)行了體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)。與對(duì)照組相比，其中15株單抗都能抑制人肝癌移植瘤在裸鼠中的生長(zhǎng)，其抑制率

5、為21-84﹪。這表明這些單抗能通過抑制人肝癌內(nèi)皮的增殖抑制移植瘤中新生血管的形成，而顯著地抑制腫瘤生長(zhǎng)。從而提示這些單抗具有靶向抑制腫瘤新生血管形成治療肝癌的潛在性應(yīng)用價(jià)值。 4.根據(jù)體內(nèi)動(dòng)物抑瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇1株抑瘤效果最好的1株單抗1B11擴(kuò)大培養(yǎng)，采用ProteinG親和層析柱純化雜交瘤上清，獲得純度大于90﹪的單抗。用該單抗，采用活細(xì)胞、固定細(xì)胞免疫熒光及免疫組化等技術(shù)進(jìn)行了亞細(xì)胞定位及組織表達(dá)特異性的研究。結(jié)果顯示該

6、單抗識(shí)別的抗原定位于內(nèi)皮細(xì)胞膜上。在肝癌組織血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)水平及陽(yáng)性率明顯地高于在正常肝組織血管內(nèi)皮的表達(dá)。提取肝癌血管內(nèi)皮細(xì)胞的總蛋白，用1B11單抗進(jìn)行了WesternBlot實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，該抗體識(shí)別的抗原蛋白的分子量為100KD。為分離該功能性蛋白/基因奠定了重要基礎(chǔ)。 研究結(jié)論： 1.從119株抗人肝癌血管內(nèi)皮細(xì)胞的單抗雜交瘤株，體外篩選獲得了16株顯著抑制人肝癌血管內(nèi)皮增殖的功能性單抗。 2.采用體