卵泡抑素相關(guān)蛋白抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究.pdf

1、一、研究背景與目的
　　血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)是循環(huán)血液與血管平滑肌間的機(jī)械屏障。VEC的功能相當(dāng)廣泛,除起轉(zhuǎn)運(yùn)屏障作用外,還具有分泌功能，可以合成分泌多種物質(zhì),對(duì)調(diào)節(jié)血管緊張度、血液流通、細(xì)胞生成、炎癥反應(yīng)、免疫等功能具有重要作用。多種因素可通過不同機(jī)制與途徑損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，使內(nèi)皮屏障作用減弱，血中脂蛋白過多地進(jìn)入動(dòng)脈壁沉積下來，被清道夫細(xì)胞吞噬形成泡沫細(xì)胞；內(nèi)皮細(xì)胞受損后，炎細(xì)胞、血小板的粘附與內(nèi)容物的釋放又加重了內(nèi)皮細(xì)胞損

2、傷，從而逐漸形成粥樣硬化斑塊，因此尋找一種應(yīng)用方便、專一性強(qiáng)、來源豐富、效果良好的VEC保護(hù)劑也越來越引起人們的重視。
　　本課題以血管內(nèi)皮細(xì)胞為靶細(xì)胞，以卵泡抑素相關(guān)蛋白（FRP）為主要研究對(duì)象，以Western Blot、Si-RNA、Rt-PCR、ChIP assay等實(shí)驗(yàn)技術(shù)為研究手段，重點(diǎn)探討FRP對(duì)VEC的保護(hù)作用，力求闡明該蛋白對(duì)VEC的抗凋亡機(jī)制及其在動(dòng)脈粥樣硬化中的病理意義。
　　二、材料與方法
　　

3、1、根據(jù)驗(yàn)證樣性的基因編碼序列獲得FRP編碼區(qū)cDNA連接于表達(dá)載體pET32a，構(gòu)建表達(dá)重組子，轉(zhuǎn)化入 Origami（DE3），1mM IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，使用Ni-NTA His Band Resins，Sephacryl S-100純化蛋白，腸激酶酶切融合蛋白并鑒定。
　　2、分離臍帶靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，并用含有胎牛血清的1640完全培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，每2-3天換液一次，定期進(jìn)行消化傳代。
　　3、將C段帶有FLA

4、G標(biāo)簽的FRP基因片段連接到pcDNA4/TO上，先后將pcDNA6/TR和pcDNA4/TO/FRP-FLAG轉(zhuǎn)染至內(nèi)皮細(xì)胞系EAHY926中，用blasticidin和zeocin篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的單克隆細(xì)胞。
　　4、制備ApoE基因敲除小鼠為背景的FRP轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，ApoE基因缺陷小鼠與ApoE基因缺陷FRP轉(zhuǎn)基因小鼠，構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型。
　　5、通過PI-Annexin-V雙染后流式細(xì)胞儀分析，研究FRP重組蛋

5、白FRP抗ox-LDL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡維持HUVEC的細(xì)胞活性。
　　6、通過rt-PCR WesternBlot等方法檢測(cè)FRP下游抗凋亡蛋白。
　　三、結(jié)果
　　1.給予ApoE缺失小鼠及ApoE基因缺陷-FRP轉(zhuǎn)基因小鼠喂養(yǎng)12周。TUNEL提示ApoE缺失小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成后血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡增加；ApoE基因缺陷-FRP轉(zhuǎn)基因小鼠TUNEL染色顯示凋亡的內(nèi)皮細(xì)胞顯著少于ApoE組。用oxLDL的終濃度依次為

6、0ug/ml、10ug/ml、20ug/ml、30ug/ml、50ug/ml（0ug/ml oxLDL作為對(duì)照組）處理HUVECs直接影響FRP的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)處理后HUVECs的FRP表達(dá)量與oxLDL的濃度呈反比。
　　2.細(xì)菌可溶性的蛋白經(jīng)Ni-His band及Sephadex Sephacryl S-100純化酶切蛋白后，得到目的蛋白。
　　3.用濃度為50ug/ml的ox-LDL處理HUVECs，與對(duì)照組相比細(xì)胞

7、變圓，貼壁細(xì)胞減少。100ng/ml的FRP重組蛋白可以抗ox-LDL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。MTT檢測(cè)提示，隨著ox-LDL濃度的增加，內(nèi)皮細(xì)胞的存活能力逐漸降低；不同濃度的FRP和ox-LDL對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行處理時(shí)，發(fā)現(xiàn)FRP可以抵抗ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，當(dāng)FRP濃度為100ng/ml時(shí)有顯著性差異。FRP濃度大于80ng/ml時(shí)可顯著提高細(xì)胞活性。FACS提示FRP可顯著降低凋亡早期annexin V陽性細(xì)胞數(shù)。
　　4.按

8、如下方法處理細(xì)胞24小時(shí)：1、空白對(duì)照組+50μg/ml LDL.2、+50μg/ml oxLDL.3、+50μg/ml oxLDL+50ng/ml FRP.4、+50μg/ml oxLDL+75ng/ml FRP.5、+50μg/ml oxLDL+100ng/ml FRP。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)RP可以上調(diào)磷酸化Akt的表達(dá)，從而激活磷酸化Akt的下游基因——磷酸化Bad的表達(dá)。然而，Akt的表達(dá)量并未隨著FRP的表達(dá)量而改變，Bcl2的表達(dá)量

9、隨著FRP濃度的增高而顯著性增加。
　　5.利用轉(zhuǎn)染Bcl2 siRNA的方法抑制Bcl2的蛋白表達(dá)，可使Bcl2蛋白表達(dá)量降低約50％（Scramble RNA組為對(duì)照組）。用FRP誘導(dǎo)Bcl2表達(dá)發(fā)現(xiàn)Bcl2 siRNA組與對(duì)照組相比Bcl2的表達(dá)量無明顯增加。在Scramble RNA組中可以觀察到FRP對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC凋亡仍有保護(hù)作用，而在Bcl2 siRNA組，F(xiàn)RP的保護(hù)作用喪失。
　　四、結(jié)論