中國人內(nèi)皮抑素-血管內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制因子融合基因治療胃癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、主要研究內(nèi)容、方法和結(jié)果如下:1、攜帶內(nèi)皮抑素-血管內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制因子融合基因重組腺病毒載體的構(gòu)建及重組腺病毒制備;設(shè)計(jì)引物用PCR方法從pBV220-hEndosatin中擴(kuò)增hENDO基因,在其5'端引入HindⅢ酶切位點(diǎn)和IL<,3>信號(hào)肽序列,3'端引入編碼纈氨酸-脯氨酸-甘氨酸-纈氨酸-甘氨酸(Val-Pro-Gly-Val-Gly)五個(gè)氨基酸的彈性蛋白連接肽(linker)序列和EocR I酶切位點(diǎn),得到647bp的IL<

2、,3>/hENDO-linker片段;用PCR方法從pUC18-VEGI<,151>擴(kuò)增VEGI<,151>片段在其5'端引入EocR I酶切位點(diǎn),3'端引入BamH I酶切位點(diǎn)得到476bp的linker-VEGI<,151>片段.產(chǎn)物經(jīng)純化后,分別克隆到pMD18-T載體,經(jīng)DNA自動(dòng)測序證明序列正確.腺病毒載體pCA13用HindⅢ和BamH I雙酶切線性化,用HindⅢ/EocR I將IL<,3>/hENDO-linker片段從

3、攜帶目的基因的pMD18-T載體上游離下來,用EocR I/BamH I將linker-VEGI<,151>片段從攜帶目的基因的pMD18-T載體上游離下來,在T<,4>DNA連接酶作用下,將線性化的pCA13與HindⅢ-EocR I IL<,3>/hENDO-linker片段和EocR I-BamH I linker-VEGI<,151>片段進(jìn)行連接,構(gòu)建成pCA13 IL<,3>/hENDO-linker-VEGI<,151>,酶

4、切鑒定連接和閱讀框正確.將pCA13 IL<,3>/hENDO-linker-VEGI<,151>與含有5型腺病毒大片段的質(zhì)粒pJM17,用LipofectAMINE介導(dǎo)共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,約10天包裝出重組腺病毒,經(jīng)過篩選及PCR鑒定證實(shí)重組腺病毒攜帶融合基因,包裝好的腺病毒命名為:Ad IL<,3>/hENDO-VEGI<,151>.同法制備攜帶報(bào)告基因LacZ重組腺病毒AdLac-Z.大量擴(kuò)增病毒,經(jīng)氯化銫梯度離心純化獲得1.1×1

5、0<'10>puf/ml滴度的重組腺病毒.2、融合基因在體外的表達(dá)與鑒定及攜帶融合基因重組腺病毒對(duì)胃癌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及生物學(xué)特性影響的體外研究.3、融合基因在活體內(nèi)的表達(dá)與鑒定及攜帶融合基因重組腺病毒治療胃癌的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究.該研究雖證實(shí)了重組腺病毒攜帶的融合基因可在體內(nèi)外表達(dá),并證實(shí)了其在體外抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖,促進(jìn)凋亡;體內(nèi)抑制腫瘤生長的肯定結(jié)果.但動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明種植瘤的生長僅僅被減慢,而與國外學(xué)者報(bào)告的使腫瘤消退到顯微狀態(tài)的