游離脂肪酸抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞功能及血管新生的機(jī)制研究.pdf

1、研究目的:
　　研究棕櫚酸對于人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞功能及血管生成的影響;闡明HIPPO信號通路在血管內(nèi)皮細(xì)胞及其血管生成中的作用;探討HIPPO信號通路與STING-IRF3信號通路在棕櫚酸誘導(dǎo)下的相互間作用與影響;研究線粒體損傷及mtDNA在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的作用，闡明在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，棕櫚酸刺激下線粒體損傷對于STING-IRF3信號通路及血管生成的影響。
　　研究方法:
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染:使用5％血清的內(nèi)皮細(xì)胞專

2、用培養(yǎng)基(ECM)于5％CO2，37℃細(xì)胞專用孵箱中培養(yǎng)人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞。細(xì)胞基因沉默采用lipofectamine2000配合siRNA進(jìn)行，采用1X Opti-MEM培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染6小時(shí)后更換條件培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染過程按照生產(chǎn)商說明書進(jìn)行;過表達(dá)基因采用lipofectamine3000及P3000轉(zhuǎn)染試劑在1X Opti-MEM中進(jìn)行，操作過程參照生產(chǎn)商說明書。
　　2.棕櫚酸(PA)的配置及對內(nèi)皮細(xì)胞的處理:采用白蛋白包被法，將用乙

3、醇溶解好的PA按比例滴入到20％不含游離脂肪酸的牛血清白蛋白溶液配制成0-5mM的PA儲存液冷凍于-20℃中保存。在使用PA刺激內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)使用ECM培養(yǎng)基按10倍比例稀釋PA存儲液至工作液濃度0-0.5mM后處理人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞至不同時(shí)間點(diǎn)，并按實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行后續(xù)必要處置。
　　3.蛋白提取及Western blot實(shí)驗(yàn):細(xì)胞處理完畢后使用Western及IP專用細(xì)胞裂解液嚴(yán)格按照說明書提取細(xì)胞蛋白，調(diào)節(jié)蛋白濃度并于95℃變性后于-

4、20℃或-80℃保存，新鮮的蛋白提取液或于4℃復(fù)溫的蛋白提取液使用SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉后4℃過夜孵育一抗，采用辣根過氧化物酶二抗配合ECL化學(xué)發(fā)光液及化學(xué)發(fā)光儀曝光并顯影目的蛋白條帶，條帶的分析采用Image J軟件。
　　4.免疫熒光實(shí)驗(yàn):細(xì)胞預(yù)先接種至鋪置10mm細(xì)胞爬片的6孔板中，處理完畢后采用免疫熒光專用固定液固定后使用TritonⅩ100打孔，采用10％山羊血清或1％BSA封閉后孵育一

5、抗，采用熒光二抗及DAPI孵育后使用激光共聚焦熒光顯微鏡或EVOS倒置熒光顯微鏡觀察拍照。
　　5.BrdU熒光增殖實(shí)驗(yàn):培養(yǎng)基中按10ug/ml的濃度于處理結(jié)束前6小時(shí)加入BrdU試劑，基本過程同免疫熒光實(shí)驗(yàn)，TritonⅩ100打孔后，使用2mol/L的HCL溶液進(jìn)行染色質(zhì)固定及PH8.3的0.1mol/L的硼酸鈉中和后繼續(xù)封閉、孵育一抗、二抗、DAPI及激光共聚焦熒光顯微鏡顯影拍照過程。
　　6.BrdU流式增殖實(shí)驗(yàn):

6、細(xì)胞接種至6孔板中，培養(yǎng)基中按10ug/ml的濃度于處理結(jié)束前6小時(shí)加入BrdU試劑，處理完畢后使用0.125％胰酶消化懸浮細(xì)胞，保持細(xì)胞懸浮狀態(tài)下進(jìn)行4％多聚甲醛固定、TritonⅩ100打孔、染色質(zhì)固定、封閉及孵育1抗過程，使用流式細(xì)胞儀檢測樣品，結(jié)果分析采用Flowjo10.0流式軟件或kaluza1.5a專用流式分析軟件進(jìn)行。
　　7.劃痕/遷移實(shí)驗(yàn):內(nèi)皮細(xì)胞于6孔板使用條件培養(yǎng)基培養(yǎng)至100％融合后使用200ul黃色移液

7、器槍頭制造劃痕，并于不同時(shí)間點(diǎn)觀察并記錄劃痕寬度，采用（最初劃痕面積-時(shí)間點(diǎn)面積）/最初劃痕面積的比率評價(jià)細(xì)胞遷移效果，采用EVOS倒置熒光顯微鏡拍照，結(jié)果分析采用Image J軟件。
　　研究結(jié)果:
　　1.棕櫚酸能抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及體外基質(zhì)的血管新生:
　　(1)BrdU增殖實(shí)驗(yàn)表明，加入PA處理后，人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖程度明顯受到抑制，并且這種抑制隨著PA濃度的升高變得更加明顯。
　　(2)劃痕

8、/遷移實(shí)驗(yàn)表明，PA可以明顯抑制人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，而且呈現(xiàn)明顯的濃度梯度性
　　(3)體外管形成實(shí)驗(yàn)表明，PA的存在的可以明顯抑制人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞形成新的血管，隨著PA的濃度升高，人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞形成新的、更多的血管的能力被明顯的削弱。
　　2.PA可以明顯激活MST并且影響YAP的功能及細(xì)胞定位:
　　(1)通過Western blot可以看出，加入PA后MST磷酸化明顯增加，并且MST總蛋白含量較對照組有所升

9、高，而YAP的磷酸化同樣較對照組明顯增加。
　　(2)通過細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PA的存在明顯阻止YAP的核轉(zhuǎn)位，加入PA后絕大多數(shù)的YAP無法進(jìn)入細(xì)胞核而滯留在細(xì)胞漿中，說明PA的存在抑制了YAP的功能。
　　(3)BrdU增殖實(shí)驗(yàn)表明，過表達(dá)YAP或人工突變YAP S127磷酸化位點(diǎn)致使YAP不能被正常磷酸化后，明顯刺激了內(nèi)皮細(xì)胞增殖及抵御PA刺激傷害的能力，增加了內(nèi)皮細(xì)胞在PA中存活的能力。
　　(4)體外管

10、形成實(shí)驗(yàn)表明，過表達(dá)YAP或人工突變YAP S127磷酸化位點(diǎn)可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成能力，并且即使在有PA的刺激下，內(nèi)皮細(xì)胞較之對照組仍形成了更多的新生血管。
　　3.MST1參與了PA對于內(nèi)皮細(xì)胞功能和血管生成的調(diào)節(jié):
　　(1)Western blot實(shí)驗(yàn)中可見，加入PA后增加了YAP的磷酸化水平，而當(dāng)下調(diào)/沉默MST1基因表達(dá)時(shí)，PA對于YAP的磷酸化出現(xiàn)明顯的減弱，表明PA正是通過MST1磷酸化了YAP。

11、　　(2)細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)可見，PA在對照組增加了YAP在細(xì)胞質(zhì)中的滯留，阻止了YAP進(jìn)入細(xì)胞核，而當(dāng)下調(diào)/沉默MST1基因表達(dá)后，更多的YAP得以進(jìn)入細(xì)胞核中，PA的阻止效果被明顯削弱。
　　(3)BrdU增殖實(shí)驗(yàn)表明，下調(diào)/沉默MST1基因表達(dá)可以明顯刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖并明顯加強(qiáng)了內(nèi)皮細(xì)胞抵御PA刺激傷害的能力，增加了內(nèi)皮細(xì)胞在PA中存活的能力。
　　(4)體外管形成實(shí)驗(yàn)表明，下調(diào)/沉默MST1基因表達(dá)可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的血

12、管生成能力，并且即使在有PA的刺激下，內(nèi)皮細(xì)胞較之對照組仍形成了更多的新生血管。
　　4.PA導(dǎo)致了線粒體的損傷并且這種損傷激活了cGAS-STING-IRF3通路:
　　(1)線粒體膜電位檢測說明，PA引起了線粒體膜電位的去極化，導(dǎo)致了線粒體膜的不穩(wěn)定及破壞，并且這種破壞在PA加入的早期便開始發(fā)生。
　　(2)細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)及實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)表明，加入PA后線粒體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，在胞漿中可見更多的雙鏈DNA的存在，

13、說明線粒體損傷后出現(xiàn)了更多的損傷的mtDNA。
　　(3)Western blot實(shí)驗(yàn)表明，PA早期導(dǎo)致了線粒體的損傷，并且激活了cGAS-STING-IRF3通路及影響了HIPPO通路，而這種作用呈現(xiàn)一定的時(shí)間先后性及順序性。
　　(4)Western blot實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)可見，使用CCCP制造線粒體損傷后，cGAS-STING-IRF3依舊被激活，蛋白表達(dá)水平明顯變化，而加入CCCP后明顯增加了IRF3的核移位

14、及導(dǎo)致STING在核周大量聚集，說明線粒體損傷的確激活了cGAS-STING-IRF3通路。
　　5.cGAS-STING-IRF3通路參與了PA對于HIPPO通路的調(diào)節(jié):
　　(1)Western blot實(shí)驗(yàn)表明:加入PA后可以激活cGAS-STING-IRF3通路及影響HIPPO通路，而無論下調(diào)/沉默cGAS-STING-IRF3通路中任一環(huán)節(jié)時(shí)，PA對于HIPPO通路的影響均明顯被削弱，說明cGAS-STING-IR

15、F3通路參與了PA對于HIPPO的影響和調(diào)節(jié)。
　　(2)細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，當(dāng)下調(diào)/沉默cGAS-STING-IRF3通路中任一環(huán)節(jié)時(shí)，PA對于HIPPO通路核心蛋白YAP的核轉(zhuǎn)位的阻止受到了明顯的削弱，進(jìn)一步證明cGAS-STING-IRF3通路參與了PA對于HIPPO的影響和調(diào)節(jié)。
　　6.PA激活了IRF3并增加了IRF3與MST1啟動子序列中結(jié)合從而促進(jìn)MST1表達(dá):
　　(1)PA的刺激可以增加MS

16、T1基因表達(dá)水平，而當(dāng)下調(diào)/沉默STING-IRF3后，MST1的基因水平較對照組出現(xiàn)明顯減少。
　　(2)通過分析MST1啟動子基因序列發(fā)現(xiàn)，其上有多個(gè)工RF3結(jié)合位點(diǎn)。
　　(3)免疫染色質(zhì)沉淀實(shí)驗(yàn)表明:PA及CCCP的刺激誘導(dǎo)并增加了IRF3與MST1啟動子序列的結(jié)合。
　　7.cGAS-STING-IRF3通路參與到了PA對于內(nèi)皮細(xì)胞功能及血管生成的調(diào)節(jié)當(dāng)中:
　　(1)BrdU增殖實(shí)驗(yàn)表明，下調(diào)/沉默c

17、GAS-STING-IRF3通路中任一環(huán)節(jié)基因表達(dá)可以明顯刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖并明顯加強(qiáng)了內(nèi)皮細(xì)胞抵御PA刺激傷害的能力，增加了內(nèi)皮細(xì)胞在PA中存活的能力
　　(2)體外管形成實(shí)驗(yàn)表明，cGAS-STING-IRF3通路中任一環(huán)節(jié)基因表達(dá)可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成能力，并且即使在有PA的刺激下，內(nèi)皮細(xì)胞較之對照組仍形成了更多的新生血管。
　　研究結(jié)論:
　　(1)棕櫚酸能夠明顯抑制內(nèi)皮細(xì)胞功能，增加其凋亡，抑制其體外基質(zhì)的