NAMPT對腦血管內(nèi)皮細胞功能及缺血性損傷的作用.pdf

1、研究背景:
　　 尼克酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Nicotinamide Phosphoribosyltransferase，NAMPT)，是尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)補救合成途徑中的限速酶，這是哺乳動物合成NAD的主要途徑。NAMPT在全身多種細胞表達，而在腦內(nèi)主要表達于神經(jīng)元以及血管內(nèi)皮細胞，NAMPT也可以分泌到細胞外包括血清中起作用。細胞內(nèi)NAMPT主要起調(diào)節(jié)細胞內(nèi)NAD水平的作用，而細胞外NAMPT被認為是一種細胞因子

2、，參與許多的反應包括介導炎癥、氧化應激等。
　　 缺血性腦卒中是一種年齡相關的疾病，能引起神經(jīng)功能的損傷，具有高致死和致殘率。在缺血性腦卒中引起的損傷中，除了神經(jīng)細胞受到損傷外，也有非神經(jīng)細胞的損傷，包括腦血管內(nèi)皮細胞和膠質(zhì)細胞。腦血管內(nèi)皮細胞對缺血非常敏感，在急性腦缺血發(fā)生后，就會出現(xiàn)腦血管內(nèi)皮細胞的功能障礙，導致血腦屏障通透性增加，引起血管性水腫，隨后出現(xiàn)血管痙攣和加重缺血損傷。內(nèi)皮細胞介導的血管再生對腦缺血后的恢復也起了非

3、常重要的作用。因此腦血管內(nèi)皮細胞也是缺血性腦卒中后很重要的治療靶細胞。
　　 研究表明，缺血性腦卒中患者血清的NAMPT也顯著增加。在大鼠腦缺血模型中，降低NAMPT的表達會導致缺血損傷加重，而增加NAMPT表達或者給予NAMPT直接產(chǎn)物NMN則對腦缺血具有保護作用。NAMPT能通過酶活性增加細胞內(nèi)NAD的水平，抑制腦缺血引起的線粒體膜電位的下降從而對缺血后的神經(jīng)元產(chǎn)生保護作用。NAMPT的終產(chǎn)物NAD已經(jīng)被認為是一種神經(jīng)保護劑

4、，在腦缺血導致的神經(jīng)元死亡和軸突變性中都具有保護作用。這些研究提示NAMPT可以成為有效預防和治療缺血性腦卒中的靶點。
　　 研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)NAMPT在維持外周血管內(nèi)皮細胞正常功能和血管重塑中起了非常重要的作用。NAMPT能促進內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和管樣形成，因此，NAMPT被認為是一種促血管再生因子。NAMPT對內(nèi)皮細胞還具有抗凋亡、抗衰老等保護作用，此外，也有體內(nèi)和體外實驗認為NAMPT與內(nèi)皮細胞的炎癥反應有關。
　　

5、 我們的研究也發(fā)現(xiàn)，在老年小鼠腦中細胞內(nèi)NAMPT明顯降低，血清中的NAMPT顯著增加，而血清中的NAMPT作為重要的細胞外NAMPT，直接作用于腦血管內(nèi)皮細胞。另外，已經(jīng)有較多的臨床研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病、肥胖等代謝性疾病患者的血清NAMPT顯著增高，而眾所周知，這些疾病患者好發(fā)缺血性腦卒中，同時腦卒中發(fā)生后的腦損傷也明顯比非代謝性疾病患者嚴重。
　　 那么這種細胞內(nèi)NAMPT降低，細胞外NAMPT增高的情況是否對腦血管內(nèi)皮細胞生理

6、功能有影響？細胞內(nèi)外的NAMPT變化對腦缺血后引起的腦血管內(nèi)皮細胞損傷是否有影響，若有，是具有保護作用呢還是具有加重損傷的作用？具體是通過何種分子機制？這些問題都尚需進一步闡明。
　　 研究目的:
　　 本文擬觀察細胞內(nèi)外NAMPT對小鼠腦血管內(nèi)皮細胞的生理功能有何影響，闡明細胞內(nèi)NAMPT對腦缺血后引起的腦血管內(nèi)皮細胞損傷的作用，揭示細胞內(nèi)NAMPT影響腦血管內(nèi)皮細胞的作用機制，包括:
　　 第一部分:NAMP

7、T對腦血管內(nèi)皮細胞生理功能的影響;
　　 第二部分:細胞內(nèi)NAMPT對腦血管內(nèi)皮細胞缺血后損傷的影響。
　　 研究方法:
　　 本文以小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞株bEnd.3細胞為主要研究對象，以NAMPT抑制劑FK866抑制細胞內(nèi)NAMPT的作用，NAMPT直接產(chǎn)物NMN模擬NAMPT增加，重組的人NAMPT和突變后失去酶活性的NAMPT/H247A模擬細胞外NAMPT增加，以缺氧缺糖模型(oxygen-glucos

8、e deprivation，OGD)為離體腦缺血性損傷模型，以OGD0.5 h和OGD4 h誘導缺血性損傷。免疫熒光染色法和免疫印跡法檢測NAMPT在腦血管內(nèi)皮細胞的表達;MTT、LDH法檢測細胞活性及損傷程度;細胞劃痕方法檢測細胞遷移;細胞計數(shù)檢測細胞數(shù)量以評價細胞增殖;PI-Hoechst染色檢測細胞凋亡和壞死;大鼠主動脈環(huán)血管再生模型評估血管再生;NAD/NADH試劑盒檢測細胞內(nèi)NAD變化;免疫熒光法檢測細胞自吞噬。
　　

9、 研究結(jié)果:
　　 第一部分NAMPT對腦血管內(nèi)皮細胞生理功能的影響
　　 在bEnd.3細胞中，用免疫熒光和免疫印跡的方法檢測到有NAMPT的表達。用FK866抑制bEnd.3細胞內(nèi)NAMPT，發(fā)現(xiàn)FK86610 nM作用24 h即能明顯降低細胞內(nèi)NAD的水平，NMN1 mM能完全補充FK866引起的NAD的減少，而單獨NMN對細胞內(nèi)NAD沒有影響。MTT和細胞遷移實驗的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)K86610-100nM能濃度依賴和

10、時間依賴的抑制細胞的增殖和遷移，高濃度FK866還可以促進細胞的凋亡。而NAMPT直接產(chǎn)物NMN0.1-1 mM能濃度依賴的逆轉(zhuǎn)FK866的作用，單獨NMN對細胞細胞活性和遷移均沒有明顯的影響。在大鼠主動脈環(huán)新生血管形成的實驗中，我們發(fā)現(xiàn)FK86610 nM雖然沒有影響新生血管的數(shù)量，但是能夠明顯抑制內(nèi)皮細胞的遷移，而FK866100 nM則能明顯抑制新生血管的生長。這些結(jié)果表明，細胞內(nèi)NAMPT通過調(diào)節(jié)NAD合成參與腦血管內(nèi)皮細胞的重

11、要生理功能，是腦血管內(nèi)皮細胞生存和維持正常功能所必需的。此外，我們在細胞外給予人重組NAMPT和突變后失去酶活性的NAMPT/H247A，發(fā)現(xiàn)在0.1-1.0μg/ml作用不同時間(24-72 h)可以促進腦血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，這一結(jié)果說明，細胞外NAMPT可以促進腦血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，并且其作用可能與NAMPT的非酶活性相關。
　　 第二部分細胞內(nèi)NAMPT對腦血管內(nèi)皮細胞缺血后損傷的影響
　　 我們對bE

12、nd.3細胞OGD0.5 h，發(fā)現(xiàn)bEnd.3細胞活性下降20％左右，但是LDH釋放和細胞數(shù)量沒有明顯改變，細胞活性在復灌24-48 h逐漸恢復正常，提示OGD0.5 h僅造成細胞輕度的一過性損傷。在24-48 h的復灌過程中，細胞內(nèi)NAD水平逐漸下降，F(xiàn)K866預給藥可以進一步減少細胞內(nèi)NAD的水平，而NMN能在OGD后補充細胞內(nèi)NAD。在OGD前24 h預先用FK86610 nM消耗細胞內(nèi)NAD可以加重OGD0.5h引起的細胞活性下

13、降，而NAMPT的直接產(chǎn)物NMN可以完全逆轉(zhuǎn)FK866預給藥引起的細胞活性下降，但是不能緩解單獨OGD0.5 h引起的細胞損傷。OGD后給予FK866或者NMN對細胞活性的恢復均無顯著影響。這一結(jié)果表明，腦血管內(nèi)皮細胞內(nèi)NAD水平的降低可以加重細胞對輕度缺血性損傷的易感性，但NAD不參與輕度OGD損傷后的腦血管內(nèi)皮細胞恢復。
　　 OGD4h導致bEnd.3細胞活性下降50％左右，同時伴LDH釋放增加和細胞數(shù)量的減少，提示有明顯

14、的細胞損傷，細胞內(nèi)NAD水平在OGD4h復灌24-48 h有增加趨勢。FK866可顯著降低復灌后細胞內(nèi)NAD水平，但NMN對OGD后及復灌過程細胞內(nèi)NAD水平均無影響。FK8661-10 nM對OGD后及復灌過程的細胞活性下降、LDH釋放均無影響，但是給予NAMPT直接產(chǎn)物NMN1 mM可以使OGD4h及復灌24-48 h的腦血管內(nèi)皮細胞活性增加、OGD后的LDH釋放減少。這一結(jié)果說明，在重度腦缺血損傷時，NMN對缺血后及復灌過程的腦血

15、管內(nèi)皮細胞具有保護作用。
　　 最后對細胞內(nèi)NAMPT在缺血損傷時的作用機制進行了探討，我們發(fā)現(xiàn)FK86610nM作用48 h和OGD4h都能明顯增加腦血管內(nèi)皮細胞的自吞噬，而NMN1 mM和自吞噬抑制劑LY294002都能抑制FK866及OGD4h引起的自吞噬的增加，但是FK866不能加重OGD4 h引起的細胞自吞噬的增加。這一結(jié)果提示，細胞內(nèi)NAMPT在腦缺血后對腦血管內(nèi)皮細胞的作用機制可能部分與自吞噬相關。
　　

16、結(jié)論:
　　 1.細胞內(nèi)NAMPT通過合成NAD參與腦血管內(nèi)皮細胞的重要生理功能，是腦血管內(nèi)皮細胞生存和維持正常功能所必需的;細胞外NAMPT可以促進腦血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，其作用可能與NAMPT的非酶活性相關。
　　 2.在輕度缺血性損傷時，抑制細胞內(nèi)NAMPT活性可以減少細胞內(nèi)NAD水平，增加腦血管內(nèi)皮細胞對損傷的易感性;在重度缺血性損傷時，增加細胞內(nèi)NAMPT，補充細胞內(nèi)NAD，可以對腦血管內(nèi)皮細胞起保護作用;