血管內皮細胞自噬的調控及膜聯(lián)蛋白A7促進內皮細胞自噬作用的研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　 巨自噬(以下簡稱自噬)是真核細胞中一種保守的溶酶體依賴的降解機制。胞質中內源性的長壽命蛋白和多余或異常的細胞器被雙層膜包被，形成泡狀結構，稱為自噬小體。后者與溶酶體或內體發(fā)生質膜融合。自噬小體與溶酶體融合形成自噬溶酶體(autophagolysosome)，溶酶體酸性水解酶將自噬溶酶體的內膜和包含物降解成氨基酸、單糖、核苷酸等小分子，被細胞重新利用，從而實現(xiàn)營養(yǎng)物質的循環(huán)和受損細胞器的清除。這一過程不僅僅

2、為細胞的基礎功能提供養(yǎng)料，同時在抵抗微生物侵入、蛋白錯誤折疊、內質網脅迫、氧化壓力過程中提高細胞適應性促進存活。另一方面，自噬還是一種細胞死亡方式，稱為Ⅱ型程序性細胞死亡，它有利于保護細胞內環(huán)境，清除有害物質，維持機體穩(wěn)定和更新。越來越多的實驗證據表明自噬參與許多重大疾病，包括神經退行性病變、腫瘤、動脈粥樣硬化和老化等，因此自噬研究具有極為重要的病理生理學意義。
　　 血管內皮細胞是覆蓋在血管內膜表面并且相互緊密連接的單層細胞，

3、它有效地將血液和血管壁分隔開來。血管內皮細胞具有信息傳遞、內分泌、參與凝血、炎癥反應和血管生成等多種重要的生理功能。因內皮細胞功能紊亂而引起的高血壓、動脈粥樣硬化、心力衰竭、腦卒中等疾病嚴重威脅著人類的健康和生命。維持內皮細胞正常功能具有重大臨床意義。目前越來越多的研究關注于自噬及其調控在血管內皮細胞正常生理功能中發(fā)揮的作用，那么血管內皮細胞自噬的內在分子機制是什么?啟動血管內皮細胞自噬的分子開關到底有哪些?它們是否參與經典的自噬信號通

4、路呢?這些都有待于進一步深入研究。
　　 膜聯(lián)蛋白(Annexins)是廣泛存在于動植物中的一類Ca2+調節(jié)的，與帶負電荷膜磷脂相結合的一類保守的蛋白超家族。在細胞中參與膜轉運和膜表面一系列依賴于鈣調蛋白的活動，包括囊泡運輸、胞吐作用中的質膜融合、信號傳導和鈣離子通道的形成、炎癥反應、細胞分化和細胞骨架蛋白間的相互作用等。目前已知Annexin家族成員約有20多種，分A、B、C、D、E五大類。所有Annexin超家族成員均具有一

5、個保守的中心結構域(core domain)和一個發(fā)揮各自獨特功能的N端結構域。其中心結構域為含有重復序列的保守結構，由4個同源的重復序列(annexin A6含有8個同源的重復序列)組成，每個重復序列含有70～80個氨基酸殘基組成的5個α螺旋，排列成彎曲的盤狀。Annexin的N端均含有鈣結合蛋白S100蛋白家族共有的鈣結合位點和磷酸化位點。腫瘤抑制基因annexin A7(ANXA7)定位與染色體10q21上，轉錄后經過不同的剪切形

6、成兩種異形體，分子量分別是47 kD和51 kD。ANXA7與鈣離子和磷脂結合發(fā)揮Ca2+激活的GTPase活性參與質膜融合。二型肺泡細胞在分泌表面活性物質時需要片層體與細胞質膜融合。信號脂類，如甘油二脂(DAG)和磷脂酰肌醇-4，5二磷酸(PIP2)可以調節(jié)ANXA7的質膜融合特性。分離的片層體用磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C(PI-PLC)或磷脂酰膽堿特異性磷脂酶C(PC-PLC)處理后，ANXA7的融合活性明顯增強。
　　 本論

7、文利用化學遺傳學結合分子生物學的方法，研究血管內皮細胞自噬的調控，探討膜聯(lián)蛋白ANXA7在內皮細胞自噬中的作用，并進一步揭示ANXA7在自噬調控中的分子機理。從而深化對血管內皮細胞自噬機制的認識，為自噬調控提供新的有效的工具，并為臨床診療新策略提供科學的理論依據。
　　 研究內容：
　　 1.在去除血清和生長因子條件下低濃度鎘離子(Cd2+，<10μM)誘導人臍靜脈血管內皮細胞(HUVEC)自噬并抑制細胞凋亡作用。

8、>　　 2.低濃度鎘離子誘導血管內皮細胞自噬的作用機理。
　　 3.苯并噁嗪衍生物ABO誘導正常培養(yǎng)的血管內皮細胞發(fā)生自噬。
　　 4.ANXA7在ABO誘導血管內皮細胞自噬中的作用。
　　 5.ABO參與自噬調控的分子機理。
　　 研究方法：
　　 1.血管內皮細胞的分離與培養(yǎng)：參考Jatfe等的方法(Jaffe et al.，1973)。
　　 2.細胞自噬和自噬流的檢測：
　

9、　 1)吖啶橙染色結合熒光顯微鏡觀察血管內皮細胞中酸性膜泡的數量及分布。
　　 2)吖啶橙染色結合流式細胞技術檢測細胞中酸性膜泡的數量。
　　 3)免疫細胞化學法檢測自噬標志物MAP1 LC3蛋白在細胞內的定量和分布。
　　 4)利用Western blot法檢測LC3-Ⅱ、beclin1和p62的蛋白水平分析自噬小體的數量以及自噬流的完整性。
　　 5)利用自噬誘導劑rapamycin誘導自噬以檢測A

10、BO引發(fā)的自噬和自噬流。
　　 6)利用自噬抑制劑3MA、bafilomycin Al以檢測ABO引發(fā)的自噬和自噬流。
　　 7)利用Western blot法檢測mTOR信號通路的下游靶點p70S6K和4EBP1的磷酸化情況。
　　 3.細胞凋亡檢測：
　　 1)倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化。
　　 2)吖啶橙染色結合激光掃描共聚焦顯微鏡觀察細胞核凝集及片斷化。
　　 3)利用TUNE

11、L方法檢測細胞凋亡率。
　　 4.磷脂酰膽堿特異性磷脂酶C(PC-PLC)活性檢測：參考吳興中等人的方法(Wuet al.，1997)。
　　 5.利用RNA干擾技術降低蛋白表達水平：利用化學合成的siRNA特異性阻斷血管內皮細胞中ANXA7的表達。
　　 6.利用真核細胞過表達系統(tǒng)特異性上調蛋白表達：
　　 1)利用含annexin A7全長的表達載體pCMV6-XL5-ANXA7特異性上調血管內皮細胞

12、中ANXA7的蛋白表達水平。
　　 2)免疫細胞化學染色法檢測細胞內ANXA7蛋白水平。
　　 3)Western blot法檢測細胞內ANXA7蛋白水平。
　　 7.活性氧(ROS)檢測：利用熒光探針DCHF結合激光掃描共聚焦顯微鏡檢測ROS水平。
　　 8.線粒體膜電位(MMP)檢測：利用熒光探針JC-1結合激光掃描共聚焦顯微鏡檢測MMP水平。
　　 9.細胞內蛋白表達水平及分布檢測：

13、　　 1)利用免疫細胞化學染色法結合激光掃描共聚焦顯微鏡檢測ANXA7、膜整聯(lián)蛋白integrinβ4、caveolin-1的蛋白表達水平及分布。
　　 2)利用RT-PCR方法檢測細胞內ANXA7、GAPDH的mRNA水平。
　　 3)利用Western blot方法檢測LC3、beclin1、p62、ANXA7、p70S6K、p-p70S6K、4EBP1、p-4EBP1、GAPDH、β-actin的蛋白表達水平。<

14、br>　　 研究結果：
　　 1.低濃度鎘離子(Cd2+)誘導血管內皮細胞自噬并抑制因去除血清和生長因子引起的細胞凋亡
　　 1.1利用熒光探針檢測鎘離子進入血管內皮細胞的數量。結果顯示細胞中熒光強度隨鎘離子的濃度升高而升高，具有明顯的劑量依賴性。單純探針本身僅顯示微弱的熒光信號(圖1.1)。
　　 1.2倒置顯微鏡觀察結果顯示1、5、10μM鎘離子處理24 h有效地減弱了由于去除血清和生長因子引起的內皮細胞從

15、培養(yǎng)皿上脫離(圖1-2)。
　　 1.3 TUNEL實驗結果表明去除血清和生長因子明顯引發(fā)內皮細胞凋亡，細胞核出現(xiàn)碎裂。鎘離子處理后TUNEL陽性率明顯降低，但10μM鎘離子的作用有所減弱，TUNEL陽性率出現(xiàn)一定的回升(圖1-3)。
　　 1.4在去除血清和生長因子條件下，吖啶橙染色顯示低濃度的鎘離子引起細胞內的酸性膜泡增多(圖1-4)，提示細胞自噬增強的可能性。
　　 1.5 Western blot結果表明

16、自噬標記物MAPl LC3-Ⅱ的蛋白含量增多(圖1-5)，表明自噬小體增多，自噬增強。
　　 2.低濃度鎘離子(Cd2+)誘導血管內皮細胞自噬并抑制其凋亡的分子機制研究
　　 2.1分別用0、1、5、10μM鎘離子處理用不含血清和生長因子培養(yǎng)液培養(yǎng)的血管內皮細胞4 h，接著用DCHF熒光探針檢測細胞中的ROS水平。結果顯示
　　 5、10μM鎘離子處理的血管內皮細胞中探針熒光強度增強，細胞ROS水平升高(圖1-6

17、)。
　　 2.2在去除血清與生長因子的條件下，免疫細胞化學染色檢測結果表明低濃度的鎘離子降低了內皮細胞整聯(lián)蛋白integrinβ4的含量，隨著鎘離子濃度的增高integrinβ4降低程度逐漸增加，呈現(xiàn)劑量依賴性(圖1-7)。
　　 2.3免疫細胞化學染色方法檢測細胞內小窩蛋白caveolin-1的表達水平，不同濃度的鎘離子明顯降低caveolin-1水平，其中5μM鎘離子效果最顯著(圖1-8)。
　　 2.4在

18、去除血清與生長因子的條件下，不同濃度的鎘離子明顯降低細胞內PC-PLC活性，其中5μM鎘離子效果最顯著(圖1-9)。
　　 3.苯并噁嗪衍生物ABO誘導正常培養(yǎng)的血管內皮細胞發(fā)生自噬
　　 3.1應用不同濃度的苯并噁嗪衍生物ABO(10、25、50、100μM)處理血管內皮細胞24 h，吖啶橙染色結果顯示胞質內酸性膜泡增多。提前加入自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)處理抑制50μM AB

19、O引起的酸性膜泡數量增多(圖2-2A)。用流式細胞儀檢測表明ABO將細胞內的吖啶橙熒光強度由對照組的3％左右提高到50％以上(圖2-2B)。
　　 3.2小分子ABO處理血管內皮細胞24小時，將細胞固定后制成切片應用于透射電鏡觀察。ABO處理組中直徑500 nm左右的雙層膜泡數量增多(圖2-3，*所示)，表明自噬小體增多。自噬抑制劑3-MA預先處理相對減少了雙層膜結構的數量，進一步確證該雙層膜結構為自噬小體。
　　 3.

20、3利用免疫細胞化學染色方法檢測血管內皮細胞中的自噬標記物微管相關蛋白輕鏈3(MAPI LC3)。ABO(25、50、100μM)處理血管內皮細胞24 h后細胞質中出現(xiàn)明顯點狀簇集，表明LC3轉移到自噬小體膜上，提示自噬小體形成。自噬抑制劑3-MA預先處理有效減少了LC3陽性膜泡的數量，抑制ABO誘導的自噬作用(圖2-4)。
　　 3.4小分子ABO(25、50、100μM)處理血管內皮細胞24 h后提取細胞全蛋白，Western

21、 blot方法檢測LC3和自噬底物p62/SQSTM1的蛋白水平。隨著ABO濃度升高，與磷脂酰乙醇胺(PE)結合的LC3-Ⅱ的含量逐漸升高，自噬底物p62的降解增加，細胞內含量減少。自噬抑制劑3-MA預先處理有效抑制LC3-Ⅱ的上調和p62的下調(圖2-5)。
　　 3.5利用50μMABO處理血管內皮細胞0、6、12、24 h后提取細胞全蛋白檢測LC3的蛋白水平，利用自噬誘導劑雷帕霉素(rapamycin)作為陽性對照。在此時

22、間區(qū)段中，隨著時間的延長細胞內LC3-Ⅱ的含量逐漸升高，在24 h達到相對最高值(圖2-6)。
　　 3.6小分子ABO(25、50、100μM)處理血管內皮細胞24 h后提取細胞全蛋白，Western blot方法檢測自噬另一標志性蛋白beclin1的水平。結果顯示beclin1蛋白被小分子ABO上調，該作用可以被自噬抑制劑3-MA抑制(圖2-7)。
　　 3.7利用巴弗洛霉素Al(bafilomycin Al)抑制自

23、噬溶酶體中蛋白酶的活性而阻斷自噬流，進一步加入50μM小分子化合物ABO處理24 h，結果顯示ABO可以進一步增強巴弗洛霉素Al對LC3-Ⅱ的積累作用，說明ABO不是阻斷自噬小體的降解，而是促進自噬小體的生成(圖2-8)。
　　 4.膜聯(lián)蛋白ANXA7在ABO誘導內皮細胞自噬中的作用
　　 4.1小分子ABO(25、50、100μM)處理血管內皮細胞24h后提取細胞全蛋白，Western blot方法檢測膜聯(lián)蛋白ANXA

24、7的水平。隨著ABO濃度升高，ANXA7的蛋白水平被逐漸上調(圖2-9A)。利用反轉錄PCR(RT-PCR)方法檢測mRNA水平，結果顯示ABO提高ANXA7的基因表達水平(圖2-9B)。用50μM ABO處理血管內皮細胞0、6、12、24 h后ANXA7蛋白水平升高，并呈現(xiàn)出時間依賴趨勢(圖2-9C)。利用免疫細胞化學染色結合激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)50μM小分子ABO處理血管內皮細胞24 h后ANXA7在細胞內含量升高，且呈現(xiàn)出點狀

25、簇集分布的狀態(tài)(圖2-9D)。
　　 4.2利用不同濃度的ANXA7特異性干擾RNA(siANXA7，10、20、40 nM)處理血管內皮細胞24、48、72 h，免疫細胞化學染色顯示ANXA7的表達被有效抑制。在隨后的實驗中選擇40 nM處理24 h作為實驗條件(圖2-10A)。利用不同濃度的siANXA7(10、20、40 nM)處理血管內皮細胞24 h后提取全蛋白，Western blot檢測.ANXA7蛋白水平。隨著si

26、ANXA7濃度的增高，ANXA7蛋白水平逐漸降低，其中40 nM效果最明顯，確證該實驗條件有效干擾細胞內ANXA7蛋白表達(圖2-10B)。
　　 4.3通過免疫細胞化學染色結合RNA干擾技術(RNAi)研究膜聯(lián)蛋白ANXA7和自噬標記物LC3的定位情況。血管內皮細胞分別用無意義RNA(scrambleRNA，Scr)、ANXA7特異性干擾RNA(siANXA7)處理后，先后使用LC3和ANXA7抗體標記兩種蛋白。激光共聚焦顯微

27、鏡觀察結果顯示：在對照組和無意義RNA處理組，ABO處理血管內皮細胞24 h后LC3出現(xiàn)點狀簇集，同時胞質內ANXA7與LC3發(fā)生一定的共定位。而將ANXA7干擾掉之后，LC3點狀簇集的數量明顯減少。結果表明ANXA7在ABO誘導的血管內皮細胞自噬中可能發(fā)揮關鍵作用(圖2-11)。
　　 4.4利用40 nM ANXA7特異性干擾RNA(siANXA7)處理血管內皮細胞24 h，不同濃度小分子ABO(25、50、100μM)繼續(xù)

28、處理24 h。吖啶橙染色結合熒光顯微鏡觀察結果顯示：在對照組和無意義RNA處理組，ABO處理血管內皮細胞24 h，細胞內酸性膜泡數量明顯增多，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴趨勢。將ANXA7干擾掉之后，ABO處理細胞的酸性膜泡數量相對減少(圖2-12)。
　　 4.5利用40 nM ANXA7特異性干擾RNA(siANXA7)處理24 h，ABO(50μM)繼續(xù)處理血管內皮細胞24 h后提取細胞全蛋白，Western blot方法檢測AN

29、XA7和LC3-Ⅱ蛋白含量。結果顯示在無意義RNA組中ABO明顯上調ANXA7和自噬蛋白LC3-Ⅱ的蛋白含量：在siANXA7組中ANXA7含量減少，同時LC3-Ⅱ的蛋白含量相對明顯減少。表明ANXA7在ABO誘導的自噬中發(fā)揮關鍵作用(圖2.13)。
　　 4.6利用蛋白質過表達系統(tǒng)研究ANXA7過表達對自噬的影響。血管內皮細胞分別用轉染試劑Lipo2000，空質粒pCMV6-XL5，帶有ANXA7全長序列的pCMV6-XL5-

30、ANXA7質粒處理后提取細胞全蛋白，Western blot方法檢測ANXA7和LC3-Ⅱ的蛋白含量。結果顯示pCMV6-XL5-ANXA7處理組中ANXA7含量增高，LC3-Ⅱ含量明顯升高?？召|粒組中LC3-Ⅱ含量輕微升高，可能與空質粒刺激細胞產生一定的細胞反應有關(圖2-14)。
　　 5.膜聯(lián)蛋白ANXA7調控的白噬不參與經典的mTOR信號通路
　　 5.1小分子ABO(25、50、100μM)處理血管內皮細胞24

31、 h提取細胞全蛋白，Western blot方法檢測經典的自噬信號通路哺乳動物雷帕霉素靶點(mTOR)的下游分子p70S6K和4EBP1的磷酸化。雷帕霉素可以減低二者的磷酸化水平，從而誘導自噬發(fā)生。Western blot結果顯示ABO處理后p70S6K和4EBP1的磷酸化狀態(tài)沒有改變(圖2-15A)。用50μM ABO處理血管內皮細胞0、6、12、24 h后提取細胞全蛋白，Western blot結果顯示在此時間區(qū)間p70S6K和4E

32、BP1的磷酸化狀態(tài)沒有改變(圖2-15B)。表明ABO和ANXA7誘導的自噬是不依賴于mTOR信號通路的。
　　 5.2分別用Scramble RNA和40 nM ANXA7特異性干擾RNA(siANXA7)處理24 h，加入雷帕霉素處理血管內皮細胞8 h，提取細胞全蛋白檢測自噬標記物LC3-Ⅱ和自噬底物p62的蛋白水平。雷帕霉素處理的對照組、無意義RNA組和siANXA7組中，雷帕霉素均可以明顯提高LC3-Ⅱ，降低p62的水平

33、，說明ANXA7不參與雷帕霉素誘導的自噬(圖2-16)。
　　 6.苯并噁嗪衍生物ABO處理內皮細胞后ROS、MMP沒有變化
　　 6.1小分子ABO(25、50、100μM)處理血管內皮細胞24 h，利用熒光探針DCHF檢測活性氧(ROS)變化。結果顯示ABO不影響細胞內ROS水平(圖2-17A)。與ABO相反，小分子DBO(6，8-dichloro-2，3-dihydro-3-hydroxymethyl-1，4-be

34、nzoxazine)提高細胞內ROS水平。ROS清除劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)預先處理可以有效抑制ROS水平的升高(圖2-17B)。Western blot檢測結果表明：NAC清除細胞內ROS后，DBO誘導的自噬被明顯抑制，說明小分子DBO是通過ROS誘導細胞自噬的(圖2-17C)。
　　 6.2小分子ABO(25、50、100μM)處理血管內皮細胞24 h，利用熒光探針JC-1檢測細胞內線粒體膜電位(MMP)變化，結果發(fā)現(xiàn)A

35、BO不影響細胞內線粒體膜電位水平(圖2-18)。
　　 結論：
　　 1.低濃度鎘離子誘導血管內皮細胞發(fā)生自噬，抑制因去除血清和生長因子而誘發(fā)的凋亡作用。此過程中ROS水平升高，integrinβ4、caveolinl水平和PC-PLC活性降低。
　　 2.苯并噁嗪衍生物ABO激活血管內皮細胞發(fā)生自噬作用。
　　 3.苯并噁嗪衍生物ABO通過上調膜聯(lián)蛋白A7(ANXA7)的水平激活自噬，ANXA7在ABO