Sirt去乙?；冈谡{(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞自噬反應中的角色.pdf

1、隨著世界人口的老齡化，心血管病以其高發(fā)病率成為影響人類健康的重要疾病之一。血管內(nèi)皮細胞的正常功能對維持血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)、預防血管病變的發(fā)生具有重要的意義。內(nèi)皮細胞功能受血液中層流剪切力（即血液流動對血管壁造成的水平方向切應力）的調(diào)節(jié)。生理狀況下穩(wěn)定的層流剪切力能夠維持血管內(nèi)皮正常功能和代謝，而非生理性的層流剪切力（過高、過低或震蕩型的剪切力）可誘發(fā)血管內(nèi)皮功能障礙，導致多種血管疾?。ㄈ鐒用}粥樣硬化等）的發(fā)生。
　　 細胞自噬是細胞在

2、溶酶體系統(tǒng)作用下對已攝取的或原有的細胞組分進行自我消化的過程，是細胞在應激狀態(tài)下維持細胞內(nèi)大分子蛋白、細胞器循環(huán)和質(zhì)量的主要方式。自噬對內(nèi)皮細胞功能具有重要的調(diào)節(jié)作用:增強細胞對細菌感染的抵抗能力;提高細胞對饑餓、缺氧、高溫以及高激素水平的耐受;對抗細胞凋亡等作用。但是，血液層流剪切力對內(nèi)皮細胞自噬反應的調(diào)節(jié)尚未見報道。
　　 自噬反應的激活受多條信號轉(zhuǎn)導通路的調(diào)控（如胰島素受體-雷帕霉素受體通路、脂多糖-AMPK通路、整聯(lián)蛋白

3、通路和鈣離子通路等），研究表明細胞因子、糖基化產(chǎn)物和氧化低密度脂蛋白等多種因子參與內(nèi)皮細胞自噬反應過程，但具體作用機制尚未闡明。自噬過程包括自噬小體（自噬相關蛋白Atg組成，雙層膜為特征）和自噬溶酶體（自噬小體與溶酶體結合）形成。Sirtuin是NAD依賴的去乙?；讣易?Sirt1～Sirt7)，在維持基因沉默、基因組的穩(wěn)定、細胞代謝和延長細胞壽命過程中發(fā)揮重要作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)某些SIRT家族成員（如Sirt1）可能參與細胞自噬反

4、應調(diào)節(jié)，而血液層流剪切力可以影響內(nèi)皮細胞中SIRT表達和功能。然而，目前Sirt在剪切力誘導的內(nèi)皮細胞自噬反應中的作用和機制尚不明確。
　　 本研究目的是明確血管內(nèi)皮細胞中Sirt去乙酰化酶調(diào)節(jié)自噬功能的作用和機制，對于探討血液層流剪切力參與血管疾病發(fā)生發(fā)展的生物學機制、指導臨床靶向治療具有重要的意義。
　　 本論文包括了以下三部分研究內(nèi)容:
　　 第一部分:血液層流剪切力對內(nèi)皮細胞自噬反應的影響
　　

5、第二部分:Sirt1在介導內(nèi)皮細胞自噬反應中的作用及生物學機制
　　 第三部分:Sirt2在內(nèi)皮細胞氧化應激中作用的系統(tǒng)生物學研究
　　 第一部分:血液層流剪切力對內(nèi)皮細胞自噬反應的影響
　　 研究目的:
　　 探討剪切力是否能夠調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞的自噬功能;探討剪切力是否通過改變細胞內(nèi)氧化還原水平參與內(nèi)皮細胞自噬功能的維持。
　　 研究方法:
　　 1、體外實驗:采用M199培養(yǎng)基作為流體，用

6、剪切力(20dyne/cm2)作用原代人臍靜脈內(nèi)皮（HUVECs）和人毛細血管內(nèi)皮細胞8小時后，將細胞分為Shear組（剪切力作用）和Static組（無剪切力作用），培養(yǎng)4小時。體內(nèi)實驗:24周齡的C57BL雄性小鼠給予右側頸總動脈結扎48小時，左側頸總動脈作為假手術對照。
　　 2、免疫熒光檢測HUVECs內(nèi)Actin-beta的排列方向。自噬功能的檢測包括下列方法:吖啶橙染色觀察細胞內(nèi)pH值的變化;DCFH-DA直接熒光標記

7、觀察細胞內(nèi)ROS的變化;免疫熒光方法計數(shù)LC3的點狀聚集，以LC3的點狀聚集陽性細胞占總細胞的百分比評價自噬小體的形成:WB檢測LC3的蛋白表達;RT-PCR檢測自噬相關基因ATG5、Beclin-1(BECN1)、MAP_LC3的表達。用活性氧清除劑EUK-134預處理后，繼續(xù)采用上述實驗方法觀察是否能逆轉(zhuǎn)剪切力對自噬功能的調(diào)節(jié)。
　　 3、人毛細血管內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)染pEGFP-LC3質(zhì)粒，共聚焦顯微鏡觀察Shear對LC3點狀聚

8、集的影響，以LC3的點狀聚集陽性細胞占總細胞的百分比表示;用EUK-134預處理后，仍采用上述方法觀察是否能逆轉(zhuǎn)剪切力對自噬的調(diào)節(jié)。
　　 4、免疫組化觀察C57BL小鼠雙側頸總動脈結扎部位至主動脈弓段LC3水平，透射電子顯微鏡觀察雙側動脈內(nèi)皮細胞內(nèi)自噬小體的形成。
　　 研究結果:
　　 1、免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)剪切力作用12小時能夠使內(nèi)皮細胞Actin-beta沿流體流動的方向排列，證明在體外成功建立了剪切力刺激

9、細胞的模型。
　　 2、Shear可以維持內(nèi)皮細胞自噬反應:與Static組相比，Shear組LC3蛋白表達顯著升高，LC3免疫熒光的點狀聚集明顯增多，細胞溶酶體酸化增強。
　　 3、Shear對HUVECs自噬反應的調(diào)節(jié)是氧化-還原依賴的:與Static組相比，Shear組細胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生（DCFH-DA熒光）明顯增多;活性氧清除劑EUK-134明顯逆轉(zhuǎn)內(nèi)皮細胞自噬相關基因的高表達。
　　 4、與Static組

10、相比，Shear組LC3的點狀聚集明顯減少(EUK-134處理)，表明過表達pEGFP-LC3的人毛細血管內(nèi)皮細胞中剪切力對于的自噬反應的調(diào)節(jié)也是氧化-還原依賴的。
　　 5、C57BL小鼠右側頸總動脈結扎48小時后血管內(nèi)皮LC3表達減少，血管內(nèi)皮細胞內(nèi)自噬小體減少。
　　 結論:
　　 1、剪切力能夠維持內(nèi)皮細胞自噬反應。
　　 2、剪切力對內(nèi)皮細胞自噬功能的維持是氧化-還原依賴的。
　　 第二

11、部分:Sirt1在介導內(nèi)皮細胞自噬反應中的作用及生物學機制
　　 研究目的
　　 觀察H2O2是否可以模擬剪切力對內(nèi)皮細胞自噬功能的調(diào)節(jié)，明確Sirt1在對內(nèi)皮細胞自噬功能維持中的作用，探討Sirt1調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞自噬反應的生物學機制。
　　 研究方法:
　　 1、SIRT1及細胞內(nèi)自噬及相關信號蛋白的檢測:H2O2處理HUVECs后，RT-PCR檢測SIRT表達，WB檢測Sirt1、LC3、mTOR、p-

12、mTOR、ULK、p-ULK表達;Sirt1抑制劑Ex-527預處理H2O2刺激的內(nèi)皮細胞，RT-PCR檢測自噬相關基因(LC3、ATG5、Beclin-1的表達。siRNA技術敲除Sirt1后，WB檢測LC3表達，siRNA技術敲除人毛細血管內(nèi)皮細胞Sirt1后，免疫熒光計數(shù)LC3的點狀聚集，并計算其占總細胞的百分比;剪切力模型中，用Ex-527處理轉(zhuǎn)染pEGFP-LC3質(zhì)粒的人毛細血管內(nèi)皮細胞，共聚焦顯微鏡觀察LC3的點狀聚集陽性細

13、胞，并計算其占總細胞的百分比。在轉(zhuǎn)染Flag-SIRT1質(zhì)?；虬邹继J醇作用后的內(nèi)皮細胞中，WB檢測LC3表達。
　　 2、Sirt1-Foxo1a信號通路的檢測:過表達Foxo1a的內(nèi)皮細胞給予H2O2、白藜蘆醇刺激后，免疫共沉淀法檢測Foxo1a的乙?；健?nèi)皮細胞分別轉(zhuǎn)染固有活性的Foxo1a的質(zhì)粒和野生型Foxo1a的質(zhì)粒后，白藜蘆醇繼續(xù)作用后，RT-PCR法檢測自噬相關基因(LC3、ATG5、Belcin-1)表達變化

14、。RT-PCR法檢測Foxo1asiRNA與Flag-SIRT1共轉(zhuǎn)染對自噬相關基因(LC3、ATG5、Belcin-1)表達的影響。
　　 3、免疫熒光法觀察轉(zhuǎn)染Flag-SIRT1質(zhì)粒后，F(xiàn)oxo1a在HUVECs中的核轉(zhuǎn)位，RT-PCR檢測Foxo1a靶基因和自噬相關基因(LC3、ATG5、Belcin-1)表達變化。
　　 研究結果:
　　 1、RT-PCR檢測到內(nèi)皮細胞SIRT1-7表達。
　　

15、 2、剪切力增強內(nèi)皮細胞SIRT1的表達。
　　 3、H2O2對抑制自噬反應的mTOR通路無顯著影響:H2O2處理HUVECs后，mTOR、p-mTOR、ULK、p-ULK表達無顯著變化。
　　 4、H2O2上調(diào)內(nèi)皮細胞SIRT1的表達:H2O2以時間依賴方式促進內(nèi)皮細胞SIRT1基因和蛋白表達。
　　 5、Sirt1激活劑白藜蘆醇能夠增強內(nèi)皮細胞自噬反應:白藜蘆醇以時間依賴方式促進內(nèi)皮細胞Sirt1、LC3表達

16、。
　　 6、白藜蘆醇上調(diào)過表達Foxo1a的內(nèi)皮細胞中自噬相關基因的轉(zhuǎn)錄表達。
　　 7、H2O2、白藜蘆醇降低了過表達Foxo1a的內(nèi)皮細胞中Foxo1a的乙酰化表達。
　　 8、Flag-SIRT1上調(diào)了自噬相關基因的轉(zhuǎn)錄表達。
　　 9、Sirt1抑制劑能夠抑制內(nèi)皮細胞自噬反應:Sirt1抑制劑Ex-527預處理HUVECs后,H2O2對HUVECs自噬相關基因在mRNA水平上的升高作用被抑制。用

17、Ex-527處理轉(zhuǎn)染pEGFP-LC3質(zhì)粒的人毛細血管內(nèi)皮細胞，Shear組LC3的點狀聚集陽性細胞占總細胞的百分比較Static組升高的作用被抑制。
　　 10、Sirt1的siRNA能夠抑制內(nèi)皮細胞自噬反應:Sirt1的siRNA轉(zhuǎn)染HUVECs和人毛細血管內(nèi)皮細胞后，H2O2繼續(xù)作用后LC3表達降低，LC3的點狀聚集減少。
　　 11、Sirt1和自噬反應對氧化應激狀態(tài)下內(nèi)皮細胞活性的影響:Ex-527、自噬反應抑

18、制劑3-MA預處理降低了內(nèi)皮細胞的活力及對H2O2的耐受。
　　 12、Sirt1對Foxo1a在細胞內(nèi)定位的作用:分別轉(zhuǎn)染Flag-SIRT1質(zhì)粒和應用白藜蘆醇后，F(xiàn)oxo1a在HUVECs中發(fā)生核轉(zhuǎn)位;同時，F(xiàn)lag-SIRT1也提高了自噬相關基因的轉(zhuǎn)錄水平。
　　 13、Foxo1a過表達對內(nèi)皮細胞自噬反應的影響:內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)染帶活性Foxo1a的質(zhì)粒和野生型Foxo1a的質(zhì)粒后，自噬相關基因MAP_LC3轉(zhuǎn)錄水平明

19、顯升高。
　　 14、Foxo1a對過表達Flag-SIRT1的內(nèi)皮細胞自噬反應的影響:共轉(zhuǎn)染Foxo1a的siRNA與Flag-SIRT1質(zhì)粒后，HUVECs自噬相關基因表達無顯著變化。
　　 結論:
　　 Sirt1介導剪切力誘發(fā)的自噬反應，Sirt1通過去乙?；疐oxo1a調(diào)節(jié)自噬相關基因表達是Sirt1調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞自噬反應的機制之一。
　　 第三部分SIRT2在內(nèi)皮細胞氧化應激中作用的系統(tǒng)生物學研

20、究
　　 研究目的:
　　 探討內(nèi)皮細胞Sirt2在氧化應激中的作用。
　　 研究方法:
　　 采用基因芯片和RT-PCR實驗驗證原代人臍靜脈內(nèi)皮細胞Sirt2沉默后，氧化應激作用下基因表達的變化。MTS法檢測內(nèi)皮細胞活性。
　　 研究結果:
　　 1、H2O2誘導內(nèi)皮細胞的氧化應激反應
　　 2、氧化應激作用下SIRT2表達升高。
　　 3、Sirt2沉默對內(nèi)皮細胞氧化應

21、激狀態(tài)下基因轉(zhuǎn)錄組的影響:Sirt2沉默后有340個基因的表達發(fā)生變化，這些基因主要參與肌動蛋白結合和細胞代謝的生理過程。
　　 4、Sirt2敏感基因功能的生物信息學分析:轉(zhuǎn)染Sirt2的siRNA調(diào)節(jié)的基因參與跨膜受體蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶信號、鐵離子運輸、蛋白質(zhì)的運輸和定位等。這些基因和相關的功能在很大程度上與轉(zhuǎn)染Sirt1的siRNA后的相關功能是不重疊的。
　　 5、氧化應激狀態(tài)下AGK2（抑制Sirt2）對內(nèi)