去乙?；窼IRT3在草酸鈣腎結(jié)石形成中的作用和機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　通過(guò)動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)草酸鈣晶體作用下腎小管上皮細(xì)胞SIRT3的表達(dá)變化，及其對(duì)氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的影響，闡明SIRT3對(duì)草酸鈣腎結(jié)石形成的影響及機(jī)制。
　　方法：
　　構(gòu)建草酸鈣腎結(jié)晶小鼠模型，設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組，Von Kossa染色檢測(cè)小鼠腎臟鈣鹽沉積情況。通過(guò)兩組小鼠腎臟組織的基因表達(dá)譜分析和文獻(xiàn)回顧，篩選出差異表達(dá)關(guān)鍵基因Sirt3，并用qPCR和Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其表達(dá)水平。免

2、疫組化檢測(cè)兩組小鼠腎臟組織SIRT3蛋白表達(dá)，HE染色和TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩組小鼠腎臟組織凋亡的情況，檢測(cè)兩組小鼠腎臟組織活性氧的含量，ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩組小鼠血液和尿液中肌酐、尿素氮以及中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白水平。構(gòu)建草酸鈣腎結(jié)晶細(xì)胞模型（TCMK-1細(xì)胞），分別用0μg/ml、10μg/ml、100μg/ml、1000μg/ml濃度的一水草酸鈣晶體刺激細(xì)胞24小時(shí)、48小時(shí)及72小時(shí)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡和壞死率的變化，檢

3、測(cè)細(xì)胞ROS含量的變化，Western blot檢測(cè)細(xì)胞SIRT3蛋白表達(dá)的變化。通過(guò)質(zhì)粒過(guò)表達(dá)細(xì)胞SIRT3，設(shè)置對(duì)照組細(xì)胞，使用1000μg/ml濃度的一水草酸鈣晶體刺激細(xì)胞72小時(shí)后，檢測(cè)細(xì)胞活性氧的含量，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡和壞死率。
　　結(jié)果：
　　成功構(gòu)建草酸鈣腎結(jié)晶小鼠模型，實(shí)驗(yàn)組的12只小鼠均成功誘導(dǎo)出腎臟結(jié)晶?；蛐酒治鼋Y(jié)果顯示草酸鈣腎結(jié)晶小鼠和對(duì)照組間共有2425個(gè)差異表達(dá)基因，qPCR驗(yàn)證部分基因表

4、達(dá)差異，結(jié)果顯示草酸鈣腎結(jié)晶小鼠腎臟組織內(nèi)Sirt3、Nlrp6表達(dá)下調(diào)，Il1beta、Nfκb1、Stat3、Il6表達(dá)上調(diào);線(xiàn)粒體相關(guān)差異基因篩選顯示草酸鈣腎結(jié)晶小鼠腎臟組織Sirt3表達(dá)顯著降低;Western blot實(shí)驗(yàn)顯示草酸鈣腎結(jié)晶小鼠腎臟組織內(nèi)SIRT3蛋白表達(dá)明顯降低。免疫組化實(shí)驗(yàn)顯示草酸鈣腎結(jié)晶小鼠腎小管上皮細(xì)胞SIRT3蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著降低;HE染色顯示草酸鈣腎結(jié)晶小鼠腎臟皮質(zhì)和髓質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)明顯損傷及凋亡性改

5、變，TUNEL實(shí)驗(yàn)顯示草酸鈣腎結(jié)晶小鼠腎臟組織皮質(zhì)(45.6±10.2 vs.12.4±1.6，p＜0.001)和髓質(zhì)（16.8±3.4 vs.4.6±1.8，p＜0.001）每高倍鏡視野下平均凋亡細(xì)胞數(shù)明顯高于對(duì)照組小鼠;Western blot實(shí)驗(yàn)顯示草酸鈣腎結(jié)晶小鼠腎臟組織SIRT3蛋白表達(dá)明顯降低，伴有促凋亡蛋白Bax表達(dá)增加，抑制凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低;ROS檢測(cè)顯示草酸鈣腎結(jié)晶小鼠腎臟組織中ROS含量明顯高于陰性對(duì)照組（

6、41530 RFU vs.16440 RFU，p＜0.001）;小鼠腎功能生化指標(biāo)檢測(cè)顯示草酸鈣腎結(jié)晶小鼠血液肌酐值（80.45±31.73 vs.29.72±16.48μmol/L，p＜0.05）和尿液肌酐值（184.00±116.41 vs.61.38±44.07μmol/L，p＜0.05）顯著高于對(duì)照組小鼠;草酸鈣腎結(jié)晶小鼠血液尿素氮值（30.46±9.44 vs.5.89±2.38 mmol/L，p＜0.001）和尿液尿素氮值（

7、57.65±21.61 vs.37.76±8.07μmol/L，p＜0.05）顯著高于對(duì)照組小鼠;草酸鈣腎結(jié)晶小鼠血液中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白值與對(duì)照組小鼠無(wú)顯著差異（273.45±17.45 vs.275.92±30.53 mmol/L，p＞0.05），而尿液中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白值顯著高于對(duì)照組小鼠（239.54±19.42 vs.121.52±34.61μmol/L，p＜0.001）。在草酸鈣腎結(jié)晶細(xì)胞模型中，草酸鈣結(jié)晶

8、誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和壞死、活性氧增加具有濃度和時(shí)間依賴(lài)性;草酸鈣結(jié)晶下調(diào)TCMK-1細(xì)胞SIRT3的表達(dá)具有濃度和時(shí)間依賴(lài)性。過(guò)表達(dá)SIRT3后，與對(duì)照組比較，TCMK-1細(xì)胞凋亡率(8.6±0.2％vs.5.3±0.4％，p＜0.001)、壞死率（18.2±0.6％vs.14.7±0.8％，p＜0.05）和ROS水平明顯降低(1373RFU vs.530RFU,p＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　草酸鈣腎結(jié)晶通過(guò)下調(diào)腎小管上皮細(xì)