去乙?；窼IRT3在草酸鈣腎結(jié)石形成中的作用和機制研究.pdf

1、目的：
　　通過動物和細胞實驗檢測草酸鈣晶體作用下腎小管上皮細胞SIRT3的表達變化，及其對氧化應(yīng)激和細胞凋亡的影響，闡明SIRT3對草酸鈣腎結(jié)石形成的影響及機制。
　　方法：
　　構(gòu)建草酸鈣腎結(jié)晶小鼠模型，設(shè)置實驗組和陰性對照組，Von Kossa染色檢測小鼠腎臟鈣鹽沉積情況。通過兩組小鼠腎臟組織的基因表達譜分析和文獻回顧，篩選出差異表達關(guān)鍵基因Sirt3，并用qPCR和Western blot實驗驗證其表達水平。免

2、疫組化檢測兩組小鼠腎臟組織SIRT3蛋白表達，HE染色和TUNEL實驗檢測兩組小鼠腎臟組織凋亡的情況，檢測兩組小鼠腎臟組織活性氧的含量，ELISA實驗檢測兩組小鼠血液和尿液中肌酐、尿素氮以及中性粒細胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白水平。構(gòu)建草酸鈣腎結(jié)晶細胞模型（TCMK-1細胞），分別用0μg/ml、10μg/ml、100μg/ml、1000μg/ml濃度的一水草酸鈣晶體刺激細胞24小時、48小時及72小時，流式細胞儀檢測細胞凋亡和壞死率的變化，檢

3、測細胞ROS含量的變化，Western blot檢測細胞SIRT3蛋白表達的變化。通過質(zhì)粒過表達細胞SIRT3，設(shè)置對照組細胞，使用1000μg/ml濃度的一水草酸鈣晶體刺激細胞72小時后，檢測細胞活性氧的含量，流式細胞儀檢測細胞凋亡和壞死率。
　　結(jié)果：
　　成功構(gòu)建草酸鈣腎結(jié)晶小鼠模型，實驗組的12只小鼠均成功誘導出腎臟結(jié)晶?；蛐酒治鼋Y(jié)果顯示草酸鈣腎結(jié)晶小鼠和對照組間共有2425個差異表達基因，qPCR驗證部分基因表

4、達差異，結(jié)果顯示草酸鈣腎結(jié)晶小鼠腎臟組織內(nèi)Sirt3、Nlrp6表達下調(diào)，Il1beta、Nfκb1、Stat3、Il6表達上調(diào);線粒體相關(guān)差異基因篩選顯示草酸鈣腎結(jié)晶小鼠腎臟組織Sirt3表達顯著降低;Western blot實驗顯示草酸鈣腎結(jié)晶小鼠腎臟組織內(nèi)SIRT3蛋白表達明顯降低。免疫組化實驗顯示草酸鈣腎結(jié)晶小鼠腎小管上皮細胞SIRT3蛋白表達較對照組顯著降低;HE染色顯示草酸鈣腎結(jié)晶小鼠腎臟皮質(zhì)和髓質(zhì)細胞呈現(xiàn)明顯損傷及凋亡性改

5、變，TUNEL實驗顯示草酸鈣腎結(jié)晶小鼠腎臟組織皮質(zhì)(45.6±10.2 vs.12.4±1.6，p＜0.001)和髓質(zhì)（16.8±3.4 vs.4.6±1.8，p＜0.001）每高倍鏡視野下平均凋亡細胞數(shù)明顯高于對照組小鼠;Western blot實驗顯示草酸鈣腎結(jié)晶小鼠腎臟組織SIRT3蛋白表達明顯降低，伴有促凋亡蛋白Bax表達增加，抑制凋亡蛋白Bcl-2表達降低;ROS檢測顯示草酸鈣腎結(jié)晶小鼠腎臟組織中ROS含量明顯高于陰性對照組（

6、41530 RFU vs.16440 RFU，p＜0.001）;小鼠腎功能生化指標檢測顯示草酸鈣腎結(jié)晶小鼠血液肌酐值（80.45±31.73 vs.29.72±16.48μmol/L，p＜0.05）和尿液肌酐值（184.00±116.41 vs.61.38±44.07μmol/L，p＜0.05）顯著高于對照組小鼠;草酸鈣腎結(jié)晶小鼠血液尿素氮值（30.46±9.44 vs.5.89±2.38 mmol/L，p＜0.001）和尿液尿素氮值（

7、57.65±21.61 vs.37.76±8.07μmol/L，p＜0.05）顯著高于對照組小鼠;草酸鈣腎結(jié)晶小鼠血液中性粒細胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白值與對照組小鼠無顯著差異（273.45±17.45 vs.275.92±30.53 mmol/L，p＞0.05），而尿液中性粒細胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白值顯著高于對照組小鼠（239.54±19.42 vs.121.52±34.61μmol/L，p＜0.001）。在草酸鈣腎結(jié)晶細胞模型中，草酸鈣結(jié)晶

8、誘導的細胞凋亡和壞死、活性氧增加具有濃度和時間依賴性;草酸鈣結(jié)晶下調(diào)TCMK-1細胞SIRT3的表達具有濃度和時間依賴性。過表達SIRT3后，與對照組比較，TCMK-1細胞凋亡率(8.6±0.2％vs.5.3±0.4％，p＜0.001)、壞死率（18.2±0.6％vs.14.7±0.8％，p＜0.05）和ROS水平明顯降低(1373RFU vs.530RFU,p＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　草酸鈣腎結(jié)晶通過下調(diào)腎小管上皮細