VKORC1在草酸鈣結(jié)晶形成中的作用及其機制研究.pdf

1、目的:研究不同濃度草酸鈣結(jié)晶對HK-2細胞凋亡的影響，找到合適的草酸鈣結(jié)晶濃度，以排除其對后續(xù)試驗的影響，觀察過表達VKORC1蛋白對草酸鈣結(jié)晶粘附和形成能力的影響。shRNA vkorc1，觀察VKORC1蛋白下調(diào)對草酸鈣結(jié)晶形成能力的影響。推測VKORC1蛋白在草酸鈣結(jié)晶形成過程中的作用，為進一步研究腎結(jié)石形成機制提供新的方向和思路。
　　方法:將HK-2細胞鋪在六孔板中，與混有草酸鈣結(jié)晶的培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時，用Annexin

2、V/propidium iodide雙染試劑盒處理后，觀察細胞的凋亡情況。HK-2細胞分別轉(zhuǎn)染pFLAG-CMV-7.1-VKORC1，pFLAG-CMV-7.1質(zhì)粒，通過RT-PCR,Western blotting分別檢測兩組mRNA和蛋白的表達情況。在共聚焦顯微鏡下觀察并比較兩組結(jié)晶粘附和形成的差異。HK-2細胞分別轉(zhuǎn)染pGPU6/GFP/Neo-VKORC1 shRNAs和pGPU6/GFP/Neo-shRNA-NC質(zhì)粒，分別在

3、24，48，72小時行RT-PCR檢測RNA干擾的效果，篩選出干擾效果最好的質(zhì)粒。獲得穩(wěn)定的pGPU6/GFP/Neo-VKORC1shRNA和pGPU6/GFP/Neo-shRNA-NC穩(wěn)定細胞株，通過Western blotting來驗證pGPU6/GFP/Neo-VKORC1shRNA2和pGPU6/GFP/Neo-VKORC1shNC組蛋白的表達情況，然后在共聚焦顯微鏡下觀察并比較兩組結(jié)晶粘附和形成的差異。
　　結(jié)果:取不

4、同濃度熒光標記草酸鈣結(jié)晶分別為:50ug/ml，100ug/ml，400ug/ml，800ug/ml。凋亡細胞占活細胞總數(shù)的百分比:50ug/ml組為6.30±0.25;100ug/ml組為:7.0±0.64;400ug/ml組為:10.7±0.44;800ug/ml組為:17.2±0.29;mock組為:5.8土0.4。50ug/ml，100ug/ml相比于mock組沒有統(tǒng)計學(xué)意義。(P＞0.05)，400ug/ml，800ug/ml

5、與mock組有統(tǒng)計學(xué)意義。(P＜0.05)HK-2細胞分別轉(zhuǎn)染pFLAG-CMV-7.1-VKORC1和pFLAG-CMV-7.1質(zhì)粒，分別取24，48小時兩個時間點，行RT-PCR實驗得知:pFLAG-CMV-7.1-VKORC1組mRNA的表達量與pFLAG-CMV-7.1相比有顯著差異。(P＜0.001)。Westernblotting驗證實驗組VKORC1蛋白的表達量高于對照組。將轉(zhuǎn)染的pCMV-7.1-VKORC1和pFLAG

6、-CMV-7.1質(zhì)粒的HK-2細胞，與混有草酸鈣結(jié)晶的培養(yǎng)基共同培養(yǎng)48小時，通過激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)晶形成情況，在100倍視野下觀察結(jié)晶形成數(shù)目，pFLAG-CMV-7.1-VKORC1組為:14±4;pFLAG-CMV-7.1為:26±4。實驗組結(jié)晶形成能力比對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義。(P＜0.05)，分別轉(zhuǎn)染pGPU6/GFP/Neo-VKORC1shRNAs和pGPU6/GFP/Neo-shRNA-NC質(zhì)粒，取三個時間點24，4

7、8，72小時來檢測mRNA，發(fā)現(xiàn)pGPU6/GFP/Neo-VKORC1 shRNA2明顯抑制VKORC1 mRNA的表達。篩選穩(wěn)定細胞株，通過激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)晶形成情況，在100倍視野下結(jié)晶形成數(shù)目，干擾組為:65±11，NC組為:24±8，干擾組比pGPU6/GFP/Neo-shRNA-NC組有統(tǒng)計學(xué)意義。(P＜0.05)。
　　結(jié)論:低濃度的草酸鈣結(jié)晶對腎小管細胞的凋亡影響相較于對照組沒有明顯的差異。高于400ug/m