巨噬細胞參與腎乳頭鈣化斑介導草酸鈣結(jié)石形成的調(diào)控作用.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分:巨噬細胞和HMGB1在腎乳頭鈣化斑組織中的表達和作用分析
　　目的:探討巨噬細胞和HMGB1在腎乳頭鈣化斑介導草酸鈣結(jié)石形成中的作用。方法:收集13例草酸鈣腎結(jié)石患者的腎乳頭鈣化組織標本作為實驗組，同期12例行根治性腎切除術(shù)的腎腫瘤患者正常腎乳頭組織標本作為對照組。通過RT-PCR和免疫組化技術(shù)檢測HMGB1和巨噬細胞特異性標記物CD68在腎乳頭組織中的表達和分布情況，并利用透

2、射電子顯微鏡觀察腎乳頭鈣化組織中巨噬細胞、腎小管上皮細胞與草酸鈣晶體的分布情況。結(jié)果:RT-PCR和免疫組化技術(shù)檢測的結(jié)果提示實驗組中CD68和HMGB1的表達水平較對照組高。巨噬細胞主要表達于腎間質(zhì)和小血管腔，而HMGB1主要表達于腎小管上皮細胞和腎間質(zhì)。電鏡觀察到腎乳頭鈣化組織間質(zhì)中存在巨噬細胞的浸潤和巨噬細胞吞噬草酸鈣晶體的現(xiàn)象。結(jié)論:巨噬細胞、HMGB1可能參與了腎乳頭鈣化斑介導草酸鈣結(jié)石的形成過程。
　　第二部分:巨噬細

3、胞與一水草酸鈣晶體相互作用的體外研究
　　目的:觀察巨噬細胞與一水草酸鈣(calcium oxalate monohydrate，COM)晶體的相互作用和探討COM晶體刺激巨噬細胞HMGB1的表達規(guī)律。方法:在相差顯微鏡下觀察COM晶體刺激巨噬細胞后的細胞形態(tài)變化;利用活細胞成像技術(shù)觀察巨噬細胞與COM晶體相互作用的過程。用100ug/ml COM晶體刺激巨噬細胞，在刺激后0、6、12、24h和36h，RT-PCR技術(shù)檢測細胞中H

4、MGB1 mRNA的表達情況;用Western blot技術(shù)檢測細胞總蛋白和細胞漿內(nèi)HMGB1蛋白的表達情況;分別于COM晶體刺激后0、1、2h和4h，用ELISA技術(shù)檢測細胞培養(yǎng)液上清中TNF-α和IL-6的含量。結(jié)果:1、通過活細胞成像觀察到巨噬細胞通過粘附和胞飲對一水草酸鈣晶體進行吞噬和消化，并對晶體起到轉(zhuǎn)運作用。2、RT-PCR結(jié)果顯示，COM晶體刺激后0-12h，培養(yǎng)細胞中HMGB1的mRNA表達量無明顯變化，刺激后18-24

5、h培養(yǎng)細胞中HMGB1的mRNA表達量明顯增加。COM晶體刺激0-6h后，巨噬細胞漿內(nèi)HMGB1蛋白的含量較低，12-36h后，細胞漿內(nèi)HMGB1蛋白逐漸增加。COM晶體刺激后0-6h，巨噬細胞總蛋白的HMGB1蛋白含量不高，在刺激后12h細胞總蛋白HMGB1的含量開始增加，并且在刺激后24-36h保持在較高水平。3、ELISA結(jié)果顯示，COM晶體刺激2h后，細胞培養(yǎng)液上清中TNF-α和IL-6表達增加，4h達到明顯高峰。結(jié)論:1、巨噬

6、細胞具有吞噬和清除COM晶體的能力，這可能是機體對晶體在腎臟的沉積而啟動的一種免疫保護性機制。2、COM晶體可以誘導巨噬細胞HMGB1、TNF-α和IL-6炎癥因子的表達;HMGB1的分泌時間明顯晚于TNF-α和IL-6，這可能是晶體誘導腎臟慢性炎癥損傷的重要機制之一。
　　第三部分:磷酸鈣晶體刺激人腎小管上皮細胞HMGB1表達的實驗研究
　　目的:探討磷酸鈣晶體刺激人腎小管上皮細胞(HK-2)HMGB1mRNA和蛋白表達水

7、平。方法:利用相差顯微鏡觀察磷酸鈣晶體刺激后腎小管上皮細胞的形態(tài)變化;用100ug/ml磷酸鈣晶體刺激腎小管上皮細胞18h、24h、30h，用R-T PCR技術(shù)檢測細胞HMGB1mRNA相對表達量;用100ug/ml磷酸鈣晶體刺激腎小管上皮細胞0、3、6、9、12h、18h、24h和48h，用Western blot技術(shù)檢測細胞總蛋白中HMGB1的含量。結(jié)果:1、磷酸鈣晶體刺激腎小管上皮細胞18h后，HMGB1mRNA表達開始上升，至3

8、0h達到高峰，組間的差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05).2、磷酸鈣晶體刺激腎小管上皮細胞3h、6h、9h后，HMGB1蛋白表達水平與0h間的差異無統(tǒng)計學意義，但18-48h呈現(xiàn)時間依賴性增加，48小時達到高峰，與0h相比，具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。結(jié)論:磷酸鈣晶體刺激腎小管上皮細胞HMGB1持續(xù)表達的時間長，從而造成腎乳頭慢性炎性損傷，這可能是炎癥介導腎乳頭鈣化斑形成的重要原因之一。
　　第四部分:HMGB1對磷酸鈣晶體誘導

9、巨噬細胞釋放炎癥因子的協(xié)同效應研究
　　目的:探討HMGB1對磷酸鈣晶體誘導巨噬細胞釋放IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1早期炎癥因子的協(xié)同作用及其可能機制。方法:1、將巨噬細胞分為空白組、100ug/mlCaP組、100ng/mlHMGB1組、100ug/mlCaP+100ng/mlHMGB1組，干預1、2、4h后收集細胞上清液，ELISA法檢測IL-1β、IL-6、TNF-α、 MCP-1含量2、將100ug/mlC

10、aP+不同濃度HMGB1(10ng/ml，50ng/ml，100ng/ml)干預巨噬細胞4h后收集細胞上清液，ELISA法檢測 IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1含量;3、將100ug/mlCaP干預巨噬細胞1，2，4h，RT-PCR技術(shù)檢測NF-KB mRNA表達水平;4、將100ug/mlCaP+不同濃度HMGB1(100ng/ml，500ng/ml，1000ng/ml)干預巨噬細胞1h，RT-PCR技術(shù)檢測NF-KB m

11、RNA表達水平。結(jié)果:1、ELISA結(jié)果顯示100ug/mlCaP組，100ng/mlHMGB1組上清液IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1含量均高于空白組，100ug/mlCaP+100ng/mlHMGB1組上清液IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1含量均高于空白組、100ug/mlCaP組、100ng/mlHMGB1組(P＜0.05)，且呈時間依賴性;2、不同濃度HMGB1+100ug/mlCaP組細胞上清液IL-1

12、β、IL-6、TNF-α、MCP-1含量均高于100ug/mlCaP組(P＜0.05)，且呈濃度依賴性。3、100μ g/mlCaP刺激巨噬細胞1、2、4h，與對照組比較，3組巨噬細胞NF-KB mRNA相對表達量均升高，具有時間依賴性，且4h達高峰(p＜0.05)。100μ g/mlCaP+不同濃度HMGB1組的巨噬細胞NF-KBmRNA相對表達量較100μ g/mlCaP均升高(p＜0.05)，且呈濃度依賴性。結(jié)論:1.HMGB1可

13、協(xié)同CaP誘導巨噬細胞釋放IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1炎癥因子;2.HMGB1協(xié)同CaP誘導巨噬細胞釋放早期炎癥因子可能與NF-KB信號通路激活有關。
　　第五部分:巨噬細胞在磷酸鈣晶體-腎小管上皮細胞體系中的調(diào)控作用研究
　　目的:在磷酸鈣-巨噬細胞、腎小管上皮細胞的共培養(yǎng)體系中，探討磷酸鈣晶體對巨噬細胞體外遷移作用的影響以及巨噬細胞對該體系中TGF-β、MCP-1炎癥因子的調(diào)控作用。方法:采用transw

14、ell小室分層非接觸的共培養(yǎng)系統(tǒng)，A組上層小室接種巨噬細胞，下層接種腎小管上皮細胞，B組上層小室接種巨噬細胞，下層接種腎小管上皮細胞和添加磷酸鈣，觀察兩組不同時間點巨噬細胞的遷移情況。C組單純下層小室接種腎小管上皮細胞和添加磷酸鈣。D組單純下層小室接種腎小管上皮細胞。采用ELISA技術(shù)檢測B，C，D組的細胞培養(yǎng)液上清MCP-1、TGF-β濃度。RT-PCR技術(shù)檢測B，C，D組腎小管上皮細胞MCP-1、TGF-β mRNA表達水平。結(jié)果:

15、B組在磷酸鈣晶體刺激6h和9h后，與A組相比，巨噬細胞遷移的數(shù)量逐漸增多(P＜0.05)，在磷酸鈣晶體刺激12h后，兩組間的巨噬細胞遷移數(shù)量無明顯差異(P＞0.05)。ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，B組培養(yǎng)液上清中的MCP-1、TGF-β濃度分別在1，3，6h和24，48，72h與C、D組相比明顯升高(P＜0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示B組腎小管上皮細胞TGF-β、MCP-1mRNA表達水平分別在1，3，6h和24，48，72h與C、D組相比也