長鏈非編碼RNAs調(diào)控草酸鈣結(jié)晶腎損傷的作用及機制研究.pdf

1、腎結(jié)石是梗阻性腎病常見原因之一，其發(fā)病率每年攀升。腎結(jié)石是微結(jié)晶集聚組成的，其中80％是草酸鈣。草酸鈣結(jié)晶腎小管上皮細胞損傷是腎結(jié)石的早期表現(xiàn)，是同一疾病不同發(fā)展階段。因此研究腎結(jié)石靶定在早期階段有助于預防疾病的發(fā)生。結(jié)晶在腎小管的沉積會導致急性腎損傷，最終進展為終末期腎病。
　　伴隨腎功能下降的腎結(jié)石患者發(fā)生腎間質(zhì)纖維化，這一過程是多數(shù)腎臟疾病最終病理結(jié)果。大量研究表明腎間質(zhì)纖維化?？梢鹉I臟上皮細胞表型逐漸轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細胞表型，

2、就是所謂上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(Epithelial-MesenchymalTransition，EMT)。文獻報道，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化可能與細胞增殖是相關(guān)的。例如:在體外，TGF-β1刺激小鼠腎小管上皮細胞抑制在G2/M期和產(chǎn)生能夠促使周細胞轉(zhuǎn)化為成纖維細胞的促纖維化細胞因子。在體內(nèi)腎臟纖維化小鼠模型中，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化是纖維化損傷的啟動因素，抑制細胞周期在G2期。
　　長鏈非編碼RNAs(long non-coding RNAs，lncRN

3、As)是近年來學者們爭相研究熱點，它是非編碼RNAs的一種類型，長度超過200個核苷酸(Nucleotides，nt)，幾乎沒有編碼蛋白質(zhì)能力。研究表明lncRNAs在生物學進程中扮演重要角色，如調(diào)控細胞分化、增殖、凋亡等。此外，人類很多疾病中發(fā)現(xiàn)lncRNAs表達異常并且參與疾病進展，例如直腸癌，前列腺癌，腎癌，梗阻性腎病。
　　目前，lncRNAs在腎結(jié)石領(lǐng)域研究甚少，而EMT是腎結(jié)石伴隨腎間質(zhì)纖維化關(guān)鍵啟動因素之一。提出假設(shè)

4、lncRNAs是通過調(diào)節(jié)EMT影響腎結(jié)石發(fā)生發(fā)展。本課題應用lncRNAs和mRNAs芯片檢測正常小鼠腎組織和結(jié)晶組小鼠腎組織中l(wèi)ncRNAs和mRNAs表達譜差異。通過人鼠同源性對比，篩選出人的lncRNAs及其可能調(diào)控基因，并進一步探討其在腎結(jié)石中作用和機制，為將來深入研究提供理論基礎(chǔ)。
　　目的：
　　利用基因芯片和人鼠同源性分析篩選確定lncRNA-CHCHD4P4。探討CHCHD4P4在結(jié)晶腎損傷過程中的生物學功能

5、和分子調(diào)控機制，為將來臨床防治腎結(jié)石提供分子靶點。
　　方法：
　　1.用Agilent8×60K小鼠全基因組芯片對3只結(jié)晶組和3只對照組小鼠腎組織進行mRNAs和lncRNAs差異基因篩選，差異基因表達分析中采用Limma算法，篩選條件是Fold Change＞1.5，P＜0.05?；诓町恗RNAs做了基因功能分析(GO)及信號通路分析(KEGG Pathway)，得到顯著上調(diào)的GO-Term和顯著下調(diào)的GO-Term及

6、其包含的基因，及顯著上調(diào)的Pathway和顯著下調(diào)的Pathway及其包含的基因。
　　2.采用人鼠同源性序列比對，獲得與鼠同源性人的lncRNAs。采用Real-time PCR(RT-PCR)技術(shù)，在一水草酸鈣(COM)刺激人腎小管上皮細胞(HK-2)體外模型中驗證CHCHD4P4表達水平。
　　3.CHCHD4P4體外功能研究:選用HK-2細胞作為研究對象，轉(zhuǎn)染CHCHD4P4 SiRNA抑制CHCHD4P4表達水平或

7、者轉(zhuǎn)染CHCHD4P4-pcDNA3.1過表達CHCHD4P4表達水平。體外分別用實時定量PCR(RT-PCR)，免疫熒光，免疫印跡法檢測上皮間質(zhì)標志物。對于細胞增殖和凋亡生物學行為采用CCK8，Edu，流式細胞儀等檢測。
　　結(jié)果：
　　1.微陣列芯片結(jié)果顯示差異表達lncRNAs共376條，其中結(jié)晶組表達上調(diào)154條，下調(diào)222條;差異表達mRNAs共2165條，上調(diào)1421條，下調(diào)744條。
　　2.人鼠同源性篩

8、選出15對，RT-PCR驗證獲得人源lncRNA是CHCHD4P4，鼠源lncRNA是AU015836，二者在結(jié)晶組模型中均高表達。
　　3.在體外模型中，CHCHD4P4相對對照組高表達。結(jié)晶組上皮表型E-cadherin表達減少，而間質(zhì)表型vimentin，snail，ZEB1表達增加。同時結(jié)晶組細胞增殖能力減弱，凋亡水平增強，而細胞周期基本沒有變化。
　　結(jié)論：
　　1.在體外，COM刺激HK-2細胞模型中發(fā)生E

9、MT現(xiàn)象，與前期我們團隊乙醛酸鹽誘導小鼠結(jié)晶腎損傷模型結(jié)果一致。
　　2.結(jié)晶組相對對照組，CHCHD4P4高表達。CHCHD4P4 SiRNA可減弱上皮細胞表型向間質(zhì)表型轉(zhuǎn)變過程，而CHCHD4P4-pcDNA3.1可加快EMT發(fā)生。
　　3.在結(jié)晶組，CHCHD4P4可抑制細胞增殖能力，促進細胞凋亡，不改變細胞周期。
　　4.在結(jié)晶腎損傷模型中，CHCHD4P4可能通過促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化抑制細胞增殖，促進凋亡。CH