氫氣對(duì)小鼠草酸鈣結(jié)晶腎損傷的保護(hù)作用和代謝組學(xué)研究.pdf

1、第一部分氫氣吸入對(duì)小鼠草酸鈣結(jié)晶腎損傷的保護(hù)作用
　　目的:探討高濃度氫氣吸入對(duì)乙醛酸鹽誘導(dǎo)的草酸鈣結(jié)晶腎損傷的保護(hù)性作用。
　　方法:通過(guò)腹腔注射乙醛酸鹽誘導(dǎo)草酸鈣結(jié)晶腎損傷模型，氫氧霧化器制備氫氧混合氣。把24只雄性C57BL/6小鼠（8周齡），隨機(jī)分為4組（每組6只）。A、單純氮氧混合氣組(NO group):給予氮氧混合氣（67％氮?dú)?33％氧氣）吸入加腹腔注射生理鹽水(20ml-1kg-1d)干預(yù)。B、單純氫氧混合

2、氣組(HO group):給予氫氧混合氣（67％氮?dú)?33％氧氣）吸入加腹腔注射生理鹽水(20ml-1kg-1d)干預(yù)。C、草酸鈣結(jié)晶組(CaOxgroup):給予氮氧混合氣（67％氮?dú)?33％氧氣）吸入加腹腔注射乙醛酸鹽（100mg-1kg-1d）干預(yù)。D、氫氣干預(yù)結(jié)晶組(HO+CaOx group):給予氫氧混合氣（67％氫氣+33％氧氣）吸入加腹腔注射乙醛酸鹽（100mg-1kg-1d）干預(yù)。兩種干預(yù)方式間隔時(shí)間為6小時(shí)。7天后留

3、取血清、尿液和腎臟組織進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)測(cè)定血清腎臟損傷分子1(KIM-1)評(píng)價(jià)腎功能損傷情況，尿鈣尿肌酐比反映尿鈣排泄情況，腎臟組織鈣含量測(cè)定和腎臟Von Kossa染色檢測(cè)腎臟草酸鈣晶體沉積情況，腎臟組織丙二醛(MDA)、8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)、髓過(guò)氧化物酶(MPO)含量和超氧化物歧化酶(SOD)、還原型谷胱甘肽(GSH)、過(guò)氧化氫酶(CAT)活力反映腎組織氧化狀態(tài)和抗氧化能力，免疫組化法檢測(cè)腎臟骨橋蛋白(OPN)、跨膜糖蛋白

4、(CD44)、單核細(xì)胞趨化因子1(MCP-1)和白細(xì)胞介素10(IL-10)評(píng)價(jià)炎癥反應(yīng)情況，原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果:(1)與NO組相比，HO組血清KIM-1水平無(wú)明顯差別，CaOx組KIM-1水平明顯升高;而與CaOx組相比，HO+CaOx組KIM-1表達(dá)量明顯降低。(2)與NO組相比，HO組尿鈣尿肌酐比值和尿磷尿肌酐比值無(wú)明顯差別，CaOx組尿鈣尿肌酐比值和尿磷尿肌酐比值明顯

5、升高;而與CaOx組相比，HO+CaOx組尿鈣尿肌酐比值和尿磷尿肌酐比值明顯降低。(3)腎臟Von Kossa染色顯示，NO組與HO組無(wú)明顯鈣鹽沉積，CaOx組與HO+CaOx組腎臟鈣鹽沉積較明顯，主要分布在皮髓質(zhì)交界處，與CaOx組相比，HO+CaOx組鈣鹽沉積面積明顯減少;與NO組相比，HO組腎臟組織鈣含量無(wú)明顯差別，CaOx組腎臟組織鈣含量明顯增多，與CaOx組相比，HO+CaOx組腎臟組織鈣含量明顯減少。(4)與NO組相比，HO

6、組腎組織MDA、8-OHdG含量和SOD、GSH、CAT活力無(wú)明顯差別，CaOx組腎組織MDA、8-OHdG含量明顯升高，SOD、GSH、CAT活力明顯降低;而與CaOx組相比，HO+CaOx組腎組織MDA、8-OHdG含量明顯降低,SOD、GSH、CAT活力明顯升高。而這四組的MPO含量并無(wú)明顯差別。(5)免疫組化結(jié)果顯示，與NO組相比，CaOx組OPN、CD44、MCP-1、IL-10表達(dá)量明顯增多，與CaOx組相比，HO+CaOx

7、組OPN、CD44、MCP-1表達(dá)量明顯減少，而IL-10表達(dá)量明顯增多。(6) NO組與HO組無(wú)明顯TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，CaOx組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多，凋亡指數(shù)為8.7％，HO+CaOx組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較CaOx組明顯減少，凋亡指數(shù)為3.1％。
　　結(jié)論:高濃度氫氣吸入可以明顯的減輕小鼠草酸鈣結(jié)晶沉積造成的腎小管上皮損傷，減少尿鈣排泄和腎鈣含量，減少草酸鈣晶體在腎小管的沉積，可以明顯減輕氧化狀態(tài)，提高抗氧化能力，減少炎癥反應(yīng)，改善腎小

8、管上皮細(xì)胞的凋亡，從而對(duì)草酸鈣結(jié)晶腎損傷產(chǎn)生保護(hù)效應(yīng)，并且無(wú)明顯的副效應(yīng)，可能為一種理想的抗結(jié)石治療的手段。
　　第二部分氫氣減輕小鼠草酸鈣結(jié)晶腎損傷的血清代謝組學(xué)研究
　　目的:探討氫氣減輕小鼠草酸鈣結(jié)晶腎損傷的代謝產(chǎn)物變化。
　　方法:18只雄性C57BL/6小鼠（8周齡），隨機(jī)分為3組（每組6只）。A、單純氮氧混合氣組(NO group):給予氮氧混合氣（67％氮?dú)?33％氧氣）吸入加腹腔注射生理鹽水(20ml-

9、1kg-1d)干預(yù)。B、草酸鈣結(jié)晶組(CaOx group):給予氮氧混合氣（67％氮?dú)?33％氧氣）吸入加腹腔注射乙醛酸鹽(100mg-1kg-1d)干預(yù)。C、氫氣干預(yù)結(jié)晶組(HO+CaOx group):給予氫氧混合氣（67％氫氣+33％氧氣）吸入加腹腔注射乙醛酸鹽(100mg-1kg-1d)干預(yù)。兩種干預(yù)方式間隔時(shí)間為6小時(shí)，7天后留取血清標(biāo)本進(jìn)行代謝組學(xué)檢測(cè)。利用超高壓液相色譜-四級(jí)桿-時(shí)間飛行串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC/Q-TOF-M

10、S)技術(shù)對(duì)各組血清進(jìn)行代謝輪廓分析，各組數(shù)據(jù)采用偏最小二乘判別分析(PLS-DA)進(jìn)行多維分析，篩選出小鼠草酸鈣結(jié)晶腎損傷的潛在標(biāo)志物和氫氣的作用靶點(diǎn)，初步闡明其作用機(jī)制。
　　結(jié)果:代謝輪廓分析發(fā)現(xiàn)，NO組、CaOx組與HO+CaOx組的代謝輪廓能明顯區(qū)分。CaOx組與NO組相比，共有26種代謝產(chǎn)物有顯著差異，為小鼠草酸鈣結(jié)晶腎損傷的潛在標(biāo)志物，而經(jīng)高濃度氫氣吸入干預(yù)后，HO+CaOx組與CaOx組相比，有20種代謝產(chǎn)物發(fā)生了顯