新基因VKORC1的功能研究.pdf

1、第一部分：VKOR參與血管生成 維生素K環(huán)氧化物還原酶(VKOR)，它的主要功能是將維生素K環(huán)氧化物還原成維生素K的形式。雖然VKOR蛋白功能于1974年就被描述，但其基因一直沒有被發(fā)現(xiàn)。2001年實驗室從成人主動脈cDNA文庫中克隆到的一個新基因命名為Fwap10576，從2001年對Fwap10576進行了從序列到功能的研究。至本部分實驗結(jié)束時，Nature的兩篇文章證明這個基因編碼的就是VKOR。因此被命名為VKOR。

2、 它在成人的肝、腎、心臟、骨骼肌中高表達，在血管中的表達主要在內(nèi)膜。同時發(fā)現(xiàn)與成人心臟比較，胎兒心臟VKOR的表達量較高。比較VKOR在腫瘤組織和其臨近的正常組織中的表達，發(fā)現(xiàn)它在大多數(shù)腫瘤組織中表達上調(diào)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染其cDNA至腫瘤細胞系A(chǔ)549和H7402中，沒有觀察到明顯的促細胞增殖現(xiàn)象。因此推測VKOR可能參與了血管生成過程。為了證明這個推測，研究了VKOR在不同的血管細胞中、發(fā)育和病理的心臟組織中的表達情況。過表達和抑制表達是

3、否會影響內(nèi)皮細胞的增殖、遷移、黏附和微管形成。結(jié)果表明VKOR在動脈內(nèi)皮細胞中高表達，并且在病理心臟的室壁瘤組織和胎兒心臟中高表達。體外實驗表明過表達會輕微的但是明顯的促進內(nèi)皮細胞的增殖(by120％)、遷移(by118％)、黏附(by117％)和微管形成，而VKOR的反義寡核苷酸能夠抑制增殖(by67％)、遷移(by64％)、黏附(by50％)、和微管形成。 實驗證明VKOR參與血管生成過程。提示其在心血管病治療和腫瘤治療上有

4、潛在的應(yīng)用價值。 第二部分：VKORC1的單體型與動脈血管性疾病(腦卒中、冠心病、主動脈夾層)相關(guān) 背景和目的:從報道與第一部分的研究結(jié)果中，提示VKORC1參與血管生成及凝血機制，故其異常會導(dǎo)致血管性血管性疾病如腦卒中和冠心病發(fā)病率非常之高，中國人群中每¨秒就有一個因此而死亡。能夠找到這類疾病的早期預(yù)測標記意義非常明顯。維生素K環(huán)氧化物還原酶(VKOR)主要功能是參與將維生素K環(huán)氧化物還原成維生素K醌形式的反應(yīng)。而維生

5、素K醌繼續(xù)被維生素K還原酶還原成維生素K氫醌的形式，在凝血酶原前體轉(zhuǎn)化成凝血酶原的反應(yīng)中，維生素K氫醌轉(zhuǎn)化成維生素K環(huán)氧化物。維生素K依賴的蛋白被認為與動脈硬化和血栓有關(guān)。血栓和動脈硬化直接導(dǎo)致血管性疾病如缺血性腦卒中、冠心病以及出血性腦卒中、動脈夾層。近期研究發(fā)現(xiàn)VKOR的單體型與華法林劑量相關(guān)。本研究的目的是通過大型病例對照研究來調(diào)查VKOR的基因單個核苷酸多態(tài)性與血管性疾病(如腦中風(fēng)、冠心病和動脈夾層)是否具有相關(guān)性。 方

6、法和結(jié)果:首先通過測序分析VKOR的2Kb的3'非翻譯區(qū)、整個編碼區(qū)，內(nèi)含子，以及2Kb的5'非翻譯區(qū)的單個核苷酸的多態(tài)性。在50個中風(fēng)病人和50個正常人中的測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)頻率在5％以上的SNPs有5個，分別是-1639A/G位于啟動子區(qū)，+1173T/C位于第一個內(nèi)含子區(qū)，+1542C/G和+2255T/C位于第二個內(nèi)含子區(qū)，+3730G/A位于5非翻譯區(qū)。并且通過連鎖不平衡分析，發(fā)現(xiàn)這5個SNPs存在嚴重的連鎖不平衡，亦即其中任何一個

7、SNP都能夠反應(yīng)整個這個區(qū)域的單倍型。于是我們挑選了2255這個位點進行大規(guī)模臨床病例對照分析。病例為：1811個腦中風(fēng)病人，740個冠心病病人，253動脈夾層病人，其中腦中風(fēng)病人分為3個亞型-798個腦缺血，514個腔梗，499個腦出血；2968個對照(1811個匹配腦中風(fēng)，740個匹配冠心病，417個與動脈夾層對照)，全部通過臨床檢查確診。+2255位點CC+CT基因型在病人組出現(xiàn)頻率明顯高于對照組。腦中風(fēng)患者中19.7％vs11.

8、7％；冠心病患者匯總16.9％vs11¨.2％；動脈夾層患者中17.0％vs10.1％。在缺血型腦卒中中更為顯著。+2255位點CC+CT基因型頻率病人組高于對照組1.95倍。經(jīng)過多元回歸分析，排除性別、年齡、體重指數(shù)、血壓、吸煙、飲酒、血糖、高密脂蛋白、低密脂蛋白、總膽固醇、甘油三酯的影響，這種相關(guān)性仍然存在。維生素K依賴性蛋白PIVKA-Ⅱ和undercarboxylated-osteocalcin都是非羧基化的蛋白。當(dāng)維生素K的γ