心肌去乙?；窼irt3對(duì)小鼠缺血-再灌注性心律失常的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、現(xiàn)如今我國(guó)人民物質(zhì)生活水平大大提高，繼之冠心病卻成為威脅我國(guó)人民健康的第一大類疾病。隨著藥物溶栓治療、冠狀動(dòng)脈內(nèi)支架植入術(shù)及冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)等內(nèi)外科治療手段的廣泛應(yīng)用，心肌缺血/再灌注損傷（myocardial ischemia/reperfusion injury，MIRI）日益成為心血管領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。MIRI的主要表現(xiàn)形式之一是心律失常，嚴(yán)重者可發(fā)生心源性休克危及生命。因此，闡明再灌注心律失常的發(fā)生機(jī)理并尋求相應(yīng)的治療措施，是臨床治

2、療中亟待解決的重要課題。
　　再灌注心律失常的病理機(jī)制較復(fù)雜，目前的研究認(rèn)為，能量代謝障礙和心肌缺血/再灌注（myocardial ischemia/reperfusion，MI/R）后產(chǎn)生過(guò)多的活性氧簇（reactive oxygen speciecs，ROS）是再灌注損傷發(fā)生的主要病理生理基礎(chǔ)。機(jī)體自身具有ROS清除系統(tǒng)，以錳超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase，MnSOD）和過(guò)氧化氫酶

3、（catalase，CAT）為代表的抗氧化酶可有效清除過(guò)度生成的ROS。但是研究發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞缺血、缺氧時(shí)，ROS清除系統(tǒng)特別是MnSOD和CAT功能降低或喪失。ROS損傷線粒體更加重能量代謝障礙，同時(shí)也促使線粒體產(chǎn)生更多的ROS。因此我們推測(cè)保護(hù)心肌細(xì)胞線粒體功能和ROS清除系統(tǒng)中的抗氧化酶是防治再灌注心律失常的可行途徑。
　　去乙?；福⊿irtuin）蛋白家族是一類依賴煙堿胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adeni

4、ne dinucleotide，NAD+）發(fā)揮作用的組蛋白去乙酰化酶。研究發(fā)現(xiàn)Sirtuin3（Sirt3）可通過(guò)其去乙酰化作用參與調(diào)控線粒體能量代謝過(guò)程中多種重要的酶的活性，增加三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的生成。另外研究還發(fā)現(xiàn)，Sirt3可通過(guò)去乙酰化作用上調(diào)MnSOD和CAT的基因表達(dá)、增加MnSOD的活性。上述研究提示：Sirt3可通過(guò)NAD+依賴的去乙?；饔?，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞能量產(chǎn)生、清除R

5、OS等重要生物學(xué)過(guò)程。據(jù)此可以推測(cè)：Sirt3功能缺失可能是再灌注心律失常發(fā)生過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)。本研究采用Sirt3基因敲除（gene knockout，KO）小鼠模型，觀察心肌Sirt3對(duì)再灌注心律失常的影響，比較分析Sirt3表達(dá)降低是否是加重缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)心肌氧化應(yīng)激從而加重再灌注心律失常的原因，為臨床防治再灌注心律失常提供理論依據(jù)和參考資料。
　　目的:
　　1.明確

6、心肌Sirt3在MI/R引發(fā)心律失常中的關(guān)鍵作用，重點(diǎn)探討Sirt3所調(diào)控的心肌抗氧化酶系統(tǒng)在此過(guò)程中的生物學(xué)作用。
　　2.觀察Sirt3 KO是否導(dǎo)致小鼠心肌組織MnSOD和CAT的表達(dá)減少及MnSOD的活性降低，進(jìn)而增加MI/R時(shí)ROS的產(chǎn)生。
　　3.觀察NAD+治療能否提高小鼠心肌Sirt3活性，進(jìn)而增加心肌MnSOD活性，抑制ROS的過(guò)度生成，最終抑制再灌注心律失常的發(fā)生。
　　方法:
　　1.將成年

7、（3月齡）野生型（wild type，WT）和Sirt3 KO小鼠各24只隨機(jī)分成4組：對(duì)照組（Control）；假手術(shù)組（Sham）；模型組（I/R）和NAD+治療組（I/R+NR）。I/R+NR組采用腹腔注射NAD+1 mg/（kg.d）處理7天，隨后建立小鼠急性MI/R模型。Sham組小鼠開(kāi)胸后絲線穿過(guò)左冠狀動(dòng)脈前降支，但不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈。
　　2.小鼠MI/R模型制做過(guò)程中以針刺電極插于小鼠四肢皮下全程監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)肢體Ⅱ?qū)?lián)心電

8、圖。記錄再灌注心律失常的類型及發(fā)生時(shí)間。對(duì)各組小鼠心律失常類型的分析依據(jù)Lambeth會(huì)議標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)分參照Fryer的評(píng)分方法，計(jì)算MI/R30分鐘內(nèi)的心律失常評(píng)分。最后，累計(jì)各組中各時(shí)段的評(píng)分，得出分析結(jié)果。
　　3.用ROS敏感的熒光探針CM-H2DCFDA標(biāo)記心肌細(xì)胞，熒光顯微鏡下檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)H2DCFDA熒光強(qiáng)度變化，以熒光強(qiáng)度反映細(xì)胞內(nèi)ROS含量的變化。ROS陽(yáng)性細(xì)胞在整個(gè)核區(qū)被染成紅色。拍照后用圖像分析軟件Image-Pr

9、o Plus6.0(Media-Cybernetics Inc)計(jì)算平均吸光度值。
　　4.采用BCA法測(cè)定心肌蛋白濃度，用Western Blot法檢測(cè)WT組和Sirt3 KO組小鼠心肌Sirt3、MnSOD、CAT的蛋白表達(dá)水平。
　　5.心肌組織Sirt3活性采用比色法定量檢測(cè)試劑盒測(cè)定。MnSOD活性測(cè)定采用MnSOD活性試劑盒。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.采用Western Blot檢測(cè)小鼠心肌Sirt3

10、蛋白表達(dá)顯示，Sirt3表達(dá)于正常心肌組織中。與WT組小鼠相比，Sirt3 KO組小鼠心肌中Sirt3的蛋白表達(dá)水平顯著降低，表明Sirt3 KO小鼠動(dòng)物模型符合實(shí)驗(yàn)要求。
　　2.建立小鼠MI/R模型并進(jìn)行心律失常評(píng)分結(jié)果顯示：WT Sham組小鼠基本無(wú)心律失常發(fā)生，而MI/R可誘發(fā)野生型小鼠出現(xiàn)心律失常。但是，Sirt3 KO組小鼠在Sham組即可觀察到心律失常，Sirt3 KO組小鼠MI/R后心律失常評(píng)分明顯高于WT I/R

11、組小鼠。該結(jié)果提示，Sirt3 KO導(dǎo)致小鼠再灌注心律失常顯著加重。
　　3.檢測(cè)各組小鼠心肌組織ROS水平結(jié)果顯示：與Sham組相比，WT I/R組小鼠心肌ROS水平顯著增加。但是，Sirt3 KO組小鼠在Sham組即可觀察到ROS生成增加。并且，MI/R后Sirt3 KO組小鼠心肌ROS的增加程度明顯高于WT I/R組小鼠。該結(jié)果與心律失常評(píng)分結(jié)果相一致，提示Sirt3 KO導(dǎo)致MI/R小鼠心肌ROS生成顯著增加。
　　

12、4.采用Western Blot檢測(cè)各組小鼠心肌中MnSOD和CAT蛋白表達(dá)水平結(jié)果顯示，與WT組小鼠相比，Sirt3 KO組小鼠心肌中MnSOD和CAT表達(dá)水平顯著降低。該結(jié)果表明Sirt3 KO可破壞心肌ROS的清除能力。
　　5.檢測(cè)NAD+治療后各組小鼠心肌Sirt3酶活性、MnSOD酶活性，結(jié)果顯示：與WT I/R組相比，WT I/R+NR小鼠心肌Sirt3酶活性和MnSOD酶活性明顯增加，并且ROS水平顯著下降，心律失

13、常評(píng)分也明顯降低。但是，在Sirt3 KO組，與I/R組相比，I/R+NR組心肌Sirt3酶活性，MnSOD酶活性、ROS含量及心律失常評(píng)分均未見(jiàn)改善。NAD+治療引起的上述心肌保護(hù)作用基本消失。該結(jié)果進(jìn)一步提示小鼠Sirt3 KO可破壞心肌ROS的清除能力。NAD+治療可增加小鼠心肌Sirt3酶活性和MnSOD酶活性進(jìn)而降低MI/R后ROS含量減輕再灌注心律失常的發(fā)生。
　　結(jié)論：
　　1.Sirt3是重要的內(nèi)源性心肌保護(hù)