定心方防治心肌缺血再灌注心律失常的機(jī)制研究.pdf

1、一、目的 隨著冠脈介入術(shù)、搭橋術(shù)、經(jīng)皮穿刺冠狀動(dòng)脈內(nèi)成形術(shù)、內(nèi)科溶栓等療法在冠心病患者中的廣泛應(yīng)用，冠狀動(dòng)脈再通后的再灌注損傷日益成為臨床上突出的問題。缺血后的再灌注損傷已經(jīng)成為阻礙缺血心肌從血液再灌注中獲得及時(shí)、有效療效的最大障礙。心律失常是缺血再灌注損傷最主要的臨床表現(xiàn)，有時(shí)嚴(yán)重的室性心律失常還危及生命。因此，探討缺血再灌注損傷心律失常的病理機(jī)制及研究有效的防治藥物意義重大。 中醫(yī)藥防治缺血再灌注心律失常具有多層次、

2、多角度、多靶點(diǎn)的特征，包括清除氧自由基、抑制鈣超載、對(duì)一氧化氮的影響、對(duì)交感神經(jīng)的影響等途徑。這充分顯示了中醫(yī)藥在防治缺血再灌注損傷及其心律失常方面有廣闊的前景。本研究采用大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎再松開的方法復(fù)制缺血再灌注心律失常動(dòng)物模型，用中藥復(fù)方定心方對(duì)其進(jìn)行干預(yù)，研究定心方對(duì)缺血再灌注心律失常心肌細(xì)胞凋亡、心肌組織NF-κB和caspase-3表達(dá)的影響，同時(shí)利用蛋白質(zhì)組技術(shù)初步探討缺血再灌注心律失常動(dòng)物模型的心肌蛋白質(zhì)組表達(dá)譜及

3、定心方對(duì)其的影響，以更深層次地揭示定心方防治缺血再灌注心律失常的機(jī)制，為研制開發(fā)防治缺血再灌注心律失常的有效藥物奠定基礎(chǔ)。 二、方法 雄性Wistar大鼠隨機(jī)分成3組，每組10只：假手術(shù)組(SH)、再灌注組(I/R)、定心方組(DXR)。在蛋白質(zhì)組實(shí)驗(yàn)中DXR組根據(jù)有無出現(xiàn)心律失常又分為未出現(xiàn)心律失常組(DXRN)和出現(xiàn)心律失常組(DXRY)。所有動(dòng)物均適應(yīng)性喂養(yǎng)兩天。SH組大鼠每天分上午及下午兩次灌服生理鹽水，于第8天

4、進(jìn)行假手術(shù)，即進(jìn)行冠脈穿線但不結(jié)扎；I/R組大鼠亦分上午及下午兩次灌服生理鹽水，于第8天進(jìn)行手術(shù)造模；DXR組大鼠分上午及下午兩次灌服制備好的定心方藥液，于第8天進(jìn)行手術(shù)造模。灌胃量均按大鼠體重計(jì)算，每次1ml/100g。造模方法根據(jù)經(jīng)典的《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》“麻醉大鼠冠脈結(jié)扎和再灌注誘發(fā)心律失常法”，連接心電圖機(jī)和心電示波器，觀察心律失常的發(fā)生，詳細(xì)記錄再灌注期間的心律失常，并進(jìn)行室性心律失常的量化評(píng)分。造模結(jié)束后直接取出心臟，放入冰生

5、理鹽水中沖洗，分離左心室部分，并將其再分成兩部分，一部分直接放入10％中性福爾馬林溶液中固定，一部分放入-80℃冰箱中保存。 福爾馬林溶液固定后的心肌組織常規(guī)石蠟包埋、切片。常規(guī)HE染色觀察缺血再灌注心律失常時(shí)的心肌組織形態(tài)及定心方對(duì)其的保護(hù)作用。采用TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡，觀察定心方對(duì)缺血再灌注心律失常心肌細(xì)胞凋亡的影響。采用SABC免疫組化法分別檢測(cè)心肌NF-κB、caspase-3的表達(dá)，觀察定心方對(duì)缺血再灌注心律失

6、常大鼠心肌NF-κ B、caspase-3表達(dá)的影響。 冰箱保存的心肌組織用組織裂解液提取心肌總蛋白，采用Bradford法進(jìn)行心肌蛋白的定量。采用蛋白質(zhì)組最核心的雙向電泳技術(shù)分離心肌總蛋白，一向采用IPG3-10L、24cm凝膠條進(jìn)行水平的等電聚焦，二向進(jìn)行SDS-PAGE垂直電泳。電泳結(jié)束后采用硝酸銀染色法進(jìn)行凝膠染色，利用凝膠成像儀采集圖像。采用Image MasterTM 2D platinum version5.0進(jìn)行

7、圖像分析，包括蛋白點(diǎn)檢測(cè)、修正、背景消減、分子量和等電點(diǎn)的校正。以模型組心肌組織蛋白的凝膠圖像作為參考膠，其他各組與之匹配，采用軟件自動(dòng)匹配并結(jié)合人工匹配方式進(jìn)行。設(shè)定表達(dá)量相差2倍以上為差異表達(dá)范圍，軟件自動(dòng)進(jìn)行分析，給出差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)的數(shù)據(jù)信息。搜索網(wǎng)上RAT HEART-2DEPAGE數(shù)據(jù)庫(kù)的所有已鑒定蛋白點(diǎn)，與本實(shí)驗(yàn)差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行對(duì)比分析(設(shè)定誤差范圍為：PI為±0.2，MW為±1kDa)，對(duì)本實(shí)驗(yàn)的部分蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行初步的相似

8、性鑒定，為以后的質(zhì)譜鑒定提供參考。 三、結(jié)果 (一)定心方對(duì)缺血再灌注心律失常大鼠心律失常的影響。本實(shí)驗(yàn)的造模方法可以較好地制作出心律失常模型，定心方對(duì)模型大鼠具有良好的保護(hù)作用。SH組大鼠偶見室性早搏，未見其他心律失常；I/R組大鼠10例均發(fā)生心律失常，以頻發(fā)室早、室速、室顫等為主，還有少量的房室傳導(dǎo)阻滯，其中2例因室顫死亡，室性心律失常評(píng)分與SH組比較增高；DXP組有7例出現(xiàn)心律失常，以室早和室速為主，室性心律失常評(píng)

9、分與I/P組相比降低。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，各組心律失常發(fā)生率之間具有顯著性差異(P<0.05)；各組心律失常評(píng)分也具有顯著性差異(P<0.01)，其分值由高到低依次為I/R組、DXR組、SH組。 (二)定心方對(duì)缺血再灌注心律失常大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)有良好的保護(hù)作用。HE染色光鏡觀察見：SH組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，著色均勻，胞膜完整，無變性、壞死等改變；I/R組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，著色不均勻，部分區(qū)域心肌細(xì)胞濁腫；DXR組大鼠亦有心肌細(xì)胞

10、變性與壞死改變，但程度較輕，著色相對(duì)均勻，水腫變性減輕，心肌壞死范圍較小。 (三)定心方對(duì)缺血再灌注心律失常大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響。SH組大鼠心肌組織有較少量的細(xì)胞凋亡。I/R組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)比SH組增高，兩組比較具有顯著性差異(P<0.01)。DXR組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)比I/R組下降，兩組比較具有顯著性差異(P<0.01)。 (四)定心方對(duì)缺血再灌注心律失常大鼠心肌組織caspase-3和NF-κB表達(dá)的影響。

11、SH大鼠心肌組織有較少量的caspase-3和NF-κB的表達(dá)。I/R組大鼠心肌組織中Caspase-3和NF-κB的表達(dá)比SH組顯著上調(diào)，兩組比較具有顯著性差異(P<0.01)。DXR組大鼠心肌組織caspase-3和NF-κB的表達(dá)低于I/R組，兩組比較具有顯著性差異(P<0.01)。 (五)缺血再灌注心律失常大鼠心肌蛋白質(zhì)組表達(dá)譜及定心方對(duì)其的干預(yù)作用。各實(shí)驗(yàn)組心肌蛋白質(zhì)組經(jīng)雙向凝膠電泳及銀染后能獲得751±36個(gè)蛋白點(diǎn)，

12、大多數(shù)蛋白點(diǎn)集中在PH4-7和分子量20-80KD之間的區(qū)域。以I/R組為參考，各組與之匹配，匹配率為81％±4.3％。圖像分析后可發(fā)現(xiàn)部分蛋白質(zhì)在動(dòng)物造模及定心方作用后發(fā)生了明顯的質(zhì)或量的改變。其中，SH組與I/R組比較，共有33個(gè)蛋白點(diǎn)變化；DXRN組與I/R組比較，共有36個(gè)蛋白點(diǎn)變化；DXRY組與I/R組比較，共有11個(gè)蛋白點(diǎn)變化。搜索網(wǎng)上RAT HEART-2DEPAGE數(shù)據(jù)庫(kù)的所有已鑒定蛋白點(diǎn)，與本實(shí)驗(yàn)差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行對(duì)比分析

13、(設(shè)定誤差范圍為：PI為±0.2，M1W為±1kDa)，經(jīng)相似性搜索，初步鑒定了5個(gè)蛋白點(diǎn)。SSP1833、SSP2079、SSP2211、SSP545、SSP1766分別為Fructose-bisphosphate aldolase(果糖二磷酸醛縮酶)、ATP synthase alpha chain(ATP合酶α鏈)、Creatine kinase Mchain(肌酸激酶M鏈)、Myosin heavy chainl(肌球蛋白重鏈1

14、)、Alpha-actin 2(α-肌動(dòng)蛋白2)。以上這些差異蛋白質(zhì)點(diǎn)可能在缺血再灌注心律失常發(fā)生及定心方防治過程中具有重要的意義。 四、結(jié)論 (一)大鼠缺血再灌注損傷容易誘發(fā)心律失常，定心方可以明顯減少心律失常的發(fā)生率，減輕心律失常發(fā)生的嚴(yán)重程度。 (二)定心方對(duì)大鼠心肌缺血再灌注心律失常心肌組織結(jié)構(gòu)具有良好的保護(hù)作用。 (三)大鼠心肌缺血再灌注心律失常時(shí)心肌細(xì)胞凋亡明顯增加，定心方可以減少心肌細(xì)胞凋