定心方及丹參酮ⅡA防治心肌缺血-再灌注損傷的作用及機(jī)制研究.pdf

1、一、背景
　　 隨著我國(guó)人們生活水平的提高及人口老齡化的加快,冠心病的發(fā)病率和死亡率呈迅速上升趨勢(shì),是中國(guó)居民死因構(gòu)成中上升最快的疾病,已成為威脅中國(guó)公眾健康的重要疾病,從而被稱作是“人類的第一殺手”?，F(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步,使冠心病的診斷和治療有了長(zhǎng)足的進(jìn)步。靜脈溶栓術(shù)、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)、冠狀動(dòng)脈內(nèi)支架置入術(shù)等血運(yùn)重建技術(shù)廣泛運(yùn)用于臨床后,冠心病急性心肌梗死的死亡率明顯下降,但隨之而來(lái)的心肌缺血.再灌注損傷(myocardi

2、alischemia/reperfusion injury,MI/RI)又成為威脅病人生命的重要因素。因此,探討MI/RI的病理機(jī)制及研究有效的防治藥物意義重大。
　　 MI/RI是指心肌血供在短時(shí)間中斷的一定時(shí)間內(nèi)恢復(fù)血供,原缺血心肌發(fā)生較血供恢復(fù)前更為嚴(yán)重的損傷。主要表現(xiàn)為再灌注心律失常、無(wú)復(fù)流、心肌頓抑、微循環(huán)障礙、甚至猝死等一系列病情反而惡化的現(xiàn)象。其病理過(guò)程復(fù)雜,涉及多個(gè)環(huán)節(jié)。過(guò)去對(duì)于MI/RI的基礎(chǔ)和臨床研究多集中在

3、抑制氧自由基、拮抗心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載等方面,近來(lái)認(rèn)為MI/RI主要是一種炎癥反應(yīng)過(guò)程,即以中性粒細(xì)胞(PMN)為主體,血小板、血管內(nèi)皮細(xì)胞共同參與,在細(xì)胞因子、補(bǔ)體等多種生物活性物質(zhì)共同作用下,由粘附分子介導(dǎo)的PMN與血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附向心肌浸潤(rùn)并釋放大量氧自由基和酶類,在細(xì)胞、亞細(xì)胞甚至基因水平造成多種形式的損傷過(guò)程。研究表明,MI/RI時(shí)PMN的粘附、滲透、趨化、激活與穿內(nèi)皮遷移,有賴于多種粘附分子和細(xì)胞因子,其中較有影響的是腫瘤壞死因

4、子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1(Interleakin-1,IL-1)、白細(xì)胞介素-6(Intedeakin-6,IL-6)等。這些細(xì)胞因子能直接抑制心肌的收縮功能,導(dǎo)致心輸出量下降,促發(fā)心肌細(xì)胞凋亡,直接和間接地增加PMN表面粘附分子CD11b及內(nèi)皮細(xì)胞和心肌表面細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)的表達(dá)。
　　 近年來(lái),中醫(yī)藥在心血管疾病的防治上取得了很大的進(jìn)展。祖國(guó)醫(yī)學(xué)雖然沒(méi)有MI/RI的概念,但從病因、臨床表現(xiàn)、轉(zhuǎn)歸等

5、特征來(lái)看,散見(jiàn)于中醫(yī)“胸痹”、“心悸”、“厥心痛”、“脫證”等病的記載中?？偛C(jī)可概括為本虛標(biāo)實(shí),本虛者,因稟賦不足,年邁腎衰,營(yíng)血虛少引起心之陰陽(yáng)、氣血虛損,特別是心氣虛和心陰虛,并根源于脾腎；標(biāo)實(shí)者,系膏梁厚味、七情過(guò)激、勞逸失度、壅瘀生熱產(chǎn)生之氣滯、血瘀、痰濁、寒凝、熱結(jié),特別是痰瘀互結(jié),阻遏胸陽(yáng),閉塞心絡(luò),痹而致痛。臨床上多表現(xiàn)為虛實(shí)夾雜、相互轉(zhuǎn)化。治療原則以補(bǔ)益氣血、調(diào)理陰陽(yáng)、活血化瘀、化痰滌飲為主。
　　 中藥復(fù)方定

6、心方(DingXin Recipe,DXR)是我校臨床治療快速性心律失常的經(jīng)驗(yàn)方,具有清心安神、益氣活血之功效。前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)定心方能明顯減輕MI/RI,有效減少再灌注心律失常的發(fā)生。定心方主藥丹參是含有多種活性成分的中藥,臨床廣泛應(yīng)用于心血管疾病的防治。其有效成分丹參酮Ⅱ A(Tanshinone Ⅱ A)是其含量最高的脂溶性活性成分,對(duì)受損心肌有很好的保護(hù)作用。本課題組前期關(guān)于定心方防治MI/RI做了大量相關(guān)研究,但在炎癥方面的機(jī)

7、制研究涉獵較少。另外,前期蛋白質(zhì)組學(xué)研究顯示,抗增殖蛋白(Prohibitin,PHB)在MI/RI模型組和正常組間存在顯著差異表達(dá),與國(guó)外研究結(jié)果不謀而合。而且有研究證明,在腸上皮細(xì)胞炎癥因子IL-6刺激能夠增加PHB蛋白及mRNA水平的表達(dá),并且能夠誘發(fā)PHB啟動(dòng)因子激活,但在心肌方面的研究較少。
　　 二、目的
　　 本課題擬在以往研究基礎(chǔ)之上,采用大鼠MI/RI動(dòng)物模型,從心律失常評(píng)分和心肌病理兩方面觀察中藥復(fù)方

8、定心方及單體丹參酮ⅡA是否具有抑制MI/RI,發(fā)揮心臟保護(hù)作用；研究MI/RI大鼠血清中炎癥因子IL-6及心肌組織中IL-6mRNA表達(dá)的變化及定心方及丹參酮Ⅱ A對(duì)其的影響；同時(shí)在蛋白質(zhì)組學(xué)水平研究MI/RI大鼠PHB蛋白表達(dá)的變化及定心方和丹參酮Ⅱ A的干預(yù)作用；初步探討在MI/RI中,炎癥因子IL-6與PHB蛋白是否具有相關(guān)性。從而在動(dòng)物水平上證實(shí)中藥復(fù)方定心方和單體丹參酮ⅡA防治缺血性心臟病的可行性,為闡明MI/RI的發(fā)病機(jī)制、

9、研制開(kāi)發(fā)新型、安全的防治缺血性心臟病的中藥制劑提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 三、方法
　　 32只成年雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為4組,每組8只,分別為假手術(shù)組(shamoperated group,SH組)、心肌缺血一再灌注組(myocardial ischemia-reperfusiongroup,MI/RI組)、定心方干預(yù)組(DingXin Recipe group,DXR組)及丹參酮ⅡA干預(yù)組(Tanshinone

10、 ⅡA group,Tan組)。所有動(dòng)物均適應(yīng)性喂養(yǎng)7天。SH組、MI/RI組和Tan組均灌服生理鹽水,DXR組灌服定心方藥液,分上下午兩次,連續(xù)灌胃7天后,MI/RI組、DXR組和Tan組手術(shù)造模,SH組冠脈只穿線但不結(jié)扎,Tan組術(shù)前尾靜脈注射給藥。
　　 根據(jù)《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》“麻醉大鼠冠脈結(jié)扎再松開(kāi)法”改進(jìn)并制作MI/RI動(dòng)物模型。連接心電圖機(jī)和心電示波器,觀察心律失常的發(fā)生,詳細(xì)記錄再灌注期間的心律失常,并進(jìn)行室性心律

11、失常的量化評(píng)分,以評(píng)價(jià)再灌注損傷的程度；腹主動(dòng)脈取血,分離血清；取心臟,冰生理鹽水沖洗,分離左心室,一部分直接放入10％中性福爾馬林溶液中固定,一部分放入-80℃冰箱中保存。
　　 左冠脈結(jié)扎和再灌注誘發(fā)的心律失常以室早(ventricular extrasystole,VE)、室速(ventricular tachycardia,VT)、室顫(ventricular fibrillation,VF)等室性心律失常(ventri

12、cular arrhythmia,VA)為主,故根據(jù)Cutis等創(chuàng)立的VA評(píng)分方法,進(jìn)行室性心律失常評(píng)分。
　　 福爾馬林溶液固定后的心肌組織常規(guī)石蠟包埋、切片。常規(guī)HE染色觀察心肌組織形態(tài)學(xué)改變；觀察缺血.再灌注損傷時(shí)心肌組織形態(tài)的變化及定心方和丹參酮ⅡA對(duì)其的保護(hù)作用。
　　 腹主動(dòng)脈采血分離的血清,采用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測(cè)血清中IL-6的表達(dá),觀察定心方及丹參酮Ⅱ A對(duì)缺血一再灌注損傷大鼠血清IL-6

13、表達(dá)的影響。
　　 部分心肌組織提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(Real Time RT-PCR)檢測(cè)IL-6mRNA的表達(dá),觀察定心方及丹參酮Ⅱ A對(duì)再灌注損傷大鼠IL-6mRNA表達(dá)的影響。
　　 部分心肌組織提取心肌組織蛋白,進(jìn)行蛋白印跡實(shí)驗(yàn)。分別采用免疫印跡法及SABC免疫組化法檢測(cè)心肌PHB蛋白的表達(dá),觀察缺血-再灌注損傷大鼠心肌PHB蛋白表達(dá)的變化及定心方及丹參酮Ⅱ

14、A對(duì)其表達(dá)的影響。
　　 心律失常評(píng)分屬于多組等級(jí)資料,采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的秩和檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis)方法進(jìn)行分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均秩次表示。其余數(shù)據(jù)屬完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的計(jì)量資料,故采用單因素方差分析(One-WayANOVA)方法進(jìn)行分析,方差齊時(shí)用Bonferroni法進(jìn)行多重比較,方差不齊時(shí)采用Dunnett's T3法,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±準(zhǔn)差((x)±s)表示,兩個(gè)變量間的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析法

15、。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　 四、結(jié)論
　　 1、缺血-再灌注損傷容易誘發(fā)大鼠心律失常,定心方及丹參酮ⅡA可以顯著減少心律失常的發(fā)生,減輕缺血-再灌注損傷的嚴(yán)重程度。
　　 2、定心方及丹參酮Ⅱ A對(duì)缺血-再灌注損傷大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)具有良好的保護(hù)作用。
　　 3、心肌缺血-再灌注損傷引起大鼠血清IL-6含量顯著增高,定心方及丹參酮ⅡA可以顯著減少I(mǎi)L-