丹參-降香對(duì)大鼠心肌缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制的代謝組學(xué)研究.pdf

1、背景：
　　缺血性心臟病（ischemic heart disease，IHD）是世界公共衛(wèi)生關(guān)注的重大問題，具有發(fā)病率高和死亡率高的特點(diǎn)。缺血后的主要治療策略是及時(shí)恢復(fù)血供，但血液再灌注會(huì)加重缺血所致的心肌細(xì)胞損傷及心臟功能障礙，故預(yù)防和處理心肌缺血/再灌注（myocardial ischemia/reperfusion，MI/R）損傷是治療IHD的重要手段。
　　與西藥相比，中藥（traditional Chinese

2、medicine，TCM）更注重采用整體和協(xié)同的方法恢復(fù)機(jī)體陰陽能量平衡。其中丹參（Salvia Miltiorrhiza，SM）-降香（Dalbergia Odorifera，DO）或以該對(duì)藥為主要組成的方劑治療IHD療效明確，前景廣闊，千百年來在我國和日本、韓國民間一直沿用。但是由于SM-DO的藥效物質(zhì)不明確、配伍使用的科學(xué)內(nèi)涵和作用機(jī)制不清楚，導(dǎo)致SM-DO及其組成方劑的國際推廣和二次開發(fā)陷入困境。
　　代謝組學(xué)是一門能快速

3、闡明中藥多組分如何通過多器官、多系統(tǒng)、多靶點(diǎn)實(shí)現(xiàn)整體作用的組學(xué)技術(shù)，其全景式、綜合性、整體互動(dòng)性與中藥整體調(diào)節(jié)特點(diǎn)及中醫(yī)藥理論的整體觀、辨證論治不謀而合。代謝組學(xué)為中藥藥效評(píng)價(jià)及作用機(jī)制研究提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐，有助于系統(tǒng)、深刻地揭示中藥配伍的科學(xué)內(nèi)涵，有助于全面、深入地傳承和發(fā)展中醫(yī)藥理論。
　　目的：
　　1.研究丹參水提物（aqueous extract of Salvia Miltiorrhiza，SM）、降香水提

4、物（aqueous extract of Dalbergia Odorifera，DOA）、降香揮發(fā)油（volatile oil of Dalbergia Odorifera，DOO）、SM+DOA和SM+DOO對(duì)大鼠MI/R損傷的保護(hù)作用。
　　2.基于代謝組學(xué)技術(shù)尋找SM+DOO治療MI/R損傷的生物標(biāo)志物，分析SM+DOO保護(hù)心肌的作用機(jī)制。
　　3.對(duì)SM+DOO心肌保護(hù)的作用機(jī)制進(jìn)行反饋驗(yàn)證。
　　方法：

5、r>　　1.將80只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)（Sham）組、模型（Model）組、地爾硫卓（Diltiazem）組、SM組、DOA組、DOO組、SM+DOA組和SM+DOO組，每組10只，灌胃給藥7 d后結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支（left anterior descending，LAD），行缺血30 min再灌注180 min手術(shù)復(fù)制MI/R損傷模型，觀察給藥后大鼠心電圖ST段和心率變化，測(cè)量心肌梗死面積，觀察心肌損傷病理形態(tài)，檢測(cè)大鼠血

6、清肌酸激酶同工酶（creatine kinase-MB，CK-MB）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase， LDH）、腫瘤壞死因子-α（ tumor necrosis factor， TNF-α）及白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）水平，檢測(cè)大鼠血清和心肌組織超氧化歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平，檢測(cè)大鼠心肌細(xì)胞凋亡

7、情況。
　　2.基于氣相色譜-飛行時(shí)間-質(zhì)譜（ gas chromatography time-of-flight mass spectrometry，GC-TOF-MS）代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)Sham組、Model組和SM+DOO組大鼠血清進(jìn)行檢測(cè)，將獲得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理，再借助 SMICA14.1軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘法-判別分析（partial

8、 least square-discriminant analysis，PLS-DA）、正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonalpartial least square-discriminant analysis，OPLS-DA）等多元統(tǒng)計(jì)分析，全面評(píng)價(jià)SM+DOO對(duì)大鼠MI/R損傷治療效果。通過兩兩比較的OPLS-DA結(jié)果，結(jié)合變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）值及t檢

9、驗(yàn)結(jié)果，篩選出潛在的生物標(biāo)志物，并通過MetaboAnalyst3.0軟件進(jìn)行代謝通路分析。
　　3.檢測(cè)能量代謝相關(guān)的生化指標(biāo)乳酸（lactic acid，LD）、非酯化脂肪酸（non-esterified fatty acid，NEFA）、檸檬酸合成酶（citroyl synthetase，CS）、乙酰輔酶A（acetyl coenzyme A，AcCoA）/輔酶 A（coenzyme A，CoA）、三磷酸腺苷（adenosi

10、ne triphosphate，ATP）、Na+K+-ATP酶、Ca++-ATP酶及Ca++Mg++-ATP酶的含量，并采用皮爾森相關(guān)分析法將這些能量代謝相關(guān)的生化指標(biāo)和代謝組學(xué)篩選出的生物標(biāo)志物進(jìn)行關(guān)聯(lián)，以探索兩者之間的內(nèi)在聯(lián)系，驗(yàn)證 SM+DOO對(duì)大鼠 MI/R損傷的保護(hù)作用；此外，通過Western Blot檢測(cè)能量代謝相關(guān)的單磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）、乙酰輔酶A羧

11、化酶（acetyl CoA carboxylase，ACC）、肉毒堿棕櫚酸轉(zhuǎn)移酶-1（carnitine palmitoyl transterase-1， CPT-1）、丙酮酸脫氫酶激酶（pyruvate dehydrogenase kinase，PDK）及丙酮酸脫氫酶復(fù)合物（pyruvate dehydrogenase complex，PDC）的蛋白表達(dá)水平，驗(yàn)證SM+DOO對(duì)大鼠MI/R損傷保護(hù)的作用機(jī)制。
　　結(jié)果：

12、　　1.各給藥組對(duì)大鼠心肌損傷都有著不同程度的改善作用，其中SM+DOO可改善大鼠心電圖，降低心肌梗死面積，改善心肌組織的病理損傷，減少CK-MB、LDH釋放，抑制MI/R損傷引起的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，減少心肌組織凋亡，且與SM組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2. PCA、PLS-DA結(jié)果顯示Sham組、Model組、SM+DOO組代謝物集散區(qū)域能較好分離，且SM+DOO組較Model組更加接近于Sham組，說明SM+DOO可改

13、善大鼠MI/R損傷。OPLS-DA結(jié)果顯示，與Sham組相比，Model組大鼠血清中乳酸、3-羥基丁酸、磷酸、未知物、棕櫚油酸、十七酸、硬脂酸和花生四烯酸水平升高，而蘋果酸、檸檬酸、肌酸和苯丙氨酸水平降低，提示這12種內(nèi)源性物質(zhì)為MI/R損傷的潛在生物標(biāo)志物。這些內(nèi)源性物質(zhì)在SM+DOO組大鼠體內(nèi)得到了不同程度的恢復(fù)，其中3-羥基丁酸、檸檬酸、棕櫚油酸、十七酸、花生四烯酸回調(diào)水平與Model組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。代謝通路分析表明SM+

14、DOO通過降低大鼠體內(nèi)花生四烯酸、十七酸、棕櫚油酸、硬脂酸及3-羥基丁酸含量，抑制心肌對(duì)脂肪酸的攝取和氧化；通過增加三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循環(huán)中蘋果酸、檸檬酸及苯丙氨酸（生成延胡索酸，參與TCA循環(huán)）含量，增加心肌對(duì)葡萄糖的氧化利用，改善能量代謝，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。
　　3.生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果與代謝組學(xué)檢測(cè)結(jié)果相一致，分別從經(jīng)典藥理學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)角度驗(yàn)證了SM+DOO對(duì)心肌的保護(hù)作用；Western

15、Blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SM+DOO通過調(diào)控AMPK/ACC/CPT-1通路抑制脂肪酸氧化、調(diào)控PDK/PDC通路促進(jìn)葡萄糖氧化，從而減少心肌氧耗，改善能量代謝，最終發(fā)揮心肌保護(hù)作用。
　　結(jié)論：
　　SM、DO及SM-DO均具有心肌保護(hù)作用，且SM+DOO效果最優(yōu)，提示SM與DOO之間存在協(xié)同作用，推測(cè) DOO通過發(fā)揮“芳香上竄、引藥上行”功效，增強(qiáng)SM治療效果。代謝組學(xué)結(jié)果顯示MI/R損傷模型建立成功，SM+DOO治療有效，并篩